p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EGF誘導(dǎo)食管腺癌細(xì)胞表達(dá)VEGF中的作用.pdf

1、食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma，EAC）發(fā)生率的增長(zhǎng)速度居各種癌腫的第二位，目前認(rèn)為Barrett食管（Barrett's Esophagus，BE）是食管腺癌的一種癌前病變，近年來(lái)的研究表明，BE的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)，并且由BE轉(zhuǎn)化而來(lái)的食管腺癌的發(fā)病率也明顯增加，亞洲國(guó)家的BE和食管腺癌雖不如西方國(guó)家常見(jiàn)，但近年來(lái)的流行病學(xué)資料顯示也呈增加的趨勢(shì)，食管腺癌早期即可發(fā)生淋巴和遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，血管的形成

2、是促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和為腫瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)所必須的，但是在食管腺癌的發(fā)生發(fā)展中，新生血管形成的機(jī)制目前還不是十分清楚。
　　 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）家庭的一個(gè)成員，是腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生新生血管的最主要的細(xì)胞因子，是目前已知的最強(qiáng)的促進(jìn)血管生成的因子，VEGF在腫瘤組織中特異的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂和增殖，從而

3、促進(jìn)瘤體血管的新生，并加速腫瘤生長(zhǎng)，提高血管通透性，使腫瘤細(xì)胞更易于侵入和穿透血管，實(shí)現(xiàn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。在食管腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，VEGF在調(diào)節(jié)血管生成中起重要作用。食管腺癌中VEGF是高表達(dá)的，但VEGF是如何被激活的及激活的機(jī)制目前未見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。
　　 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）是細(xì)胞外各種信號(hào)從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。目前認(rèn)為，MA

4、PK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管發(fā)生及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，其成員p38MAPK是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。越來(lái)越多的研究表明，VEGF在許多惡性腫瘤例如肝癌、食管鱗癌等中的表達(dá)與p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。
　　 表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，在組織損傷修復(fù)和腫瘤形成中發(fā)揮重要作用，而且還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移，與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移

5、密切相關(guān)。表皮生長(zhǎng)因子能與細(xì)胞膜上表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）結(jié)合使其磷酸化，再經(jīng)MAPK信號(hào)通路將信號(hào)傳遞至核內(nèi)，促進(jìn)或抑制特定靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和運(yùn)動(dòng)。有研究表明，在多種腫瘤如食管癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、大腸癌等中EGF和VEGF均高表達(dá)，并且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)；體外培養(yǎng)的多種細(xì)胞系中，EGF可通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤血管生成。在食管腺癌的發(fā)生發(fā)展中，是

6、否有EGF通過(guò)激活p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以致激活VEGF而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的相關(guān)資料未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究從EGF著手，通過(guò)對(duì)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異性阻斷，研究p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EGF誘導(dǎo)食管腺癌（SEG-1）細(xì)胞表達(dá)VEGF中的作用，探討食管腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中血管形成的機(jī)制。
　　 目的：通過(guò)研究p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EGF誘導(dǎo)食管腺癌（SEG-1）細(xì)胞表達(dá)VEGF中的作用，探討食管腺癌細(xì)胞

7、轉(zhuǎn)移中血管形成的機(jī)制。
　　 方法：采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)食管腺癌（SEG-1）細(xì)胞，以相同濃度EGF（100ng/ml）按不同的時(shí)間梯度刺激細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)VEGF mRNA，Western blot法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)總p38MAPK、磷酸化p38MAPK、VEGF蛋白表達(dá)情況。并用p38MAPK特異抑制劑SB203580預(yù)處理細(xì)胞后，觀察上述指標(biāo)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1 EGF對(duì)SEG-1細(xì)

8、胞p38MAPK蛋白表達(dá)的影響：Western blot結(jié)果顯示，大約在43KD位置出現(xiàn)p38MAPK特異性條帶。EGF作用于SEG-1細(xì)胞后p38MAPK磷酸化程度有所升高，且p38MAPK磷酸化程度隨EGF作用時(shí)間的變化而變化，1h、6h、12h、24h、48h的p38MAPK磷酸化的百分比分別為13.1％、31.2％、40.7％、53.5％、42.3％，可見(jiàn)24h的p38MAPK磷酸化水平最高，因此，認(rèn)為該時(shí)間點(diǎn)為p38MAPK最

9、大磷酸化時(shí)間點(diǎn)。
　　 2 EGF對(duì)SEG-1細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響：RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA結(jié)果顯示：SEG-1細(xì)胞中有VEGF基因表達(dá)，并且隨著EGF作用時(shí)間的延長(zhǎng)，VEGFmRNA的表達(dá)水平逐漸上升，EGF作用于SEG-1細(xì)胞6h、12h、24h、48h后，VEGF mRNA表達(dá)分別為：0.494±0.034、0.728±0.067、0.948±0.046、0.806±0.059，與正常對(duì)照組（0

10、.357±0.011）相比，VEGF mRNA表達(dá)升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。VEGF mRNA表達(dá)明顯升高后逐漸下降，于24h達(dá)高峰。Western blot檢測(cè)VEGF蛋白結(jié)果顯示：EGF刺激前SEG-1細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)量較低，刺激后1h開(kāi)始上升，持續(xù)至24h達(dá)最高，呈明顯的時(shí)間依賴性。EGF作用于SEG-1細(xì)胞1h后，VEGF蛋白表達(dá)為0.431±0.031，與正常對(duì)照組（0.390±0.028）相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p

11、>0.05）。EGF作用于SEG-1細(xì)胞6h、12h、24h、48h后，VEGF蛋白表達(dá)分別為：0.484±0.042、0.794±0.031、1.000±0.024、0.869±0.023，與正常對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　 3 p38MAPK特異抑制劑SB203580處理SEG-1細(xì)胞：20μmol/L的SB203580可明顯抑制EGF誘導(dǎo)的p38MAPK激酶活力。SB203580對(duì)EGF誘導(dǎo)的SEG-1

12、細(xì)胞內(nèi)VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)亦有明顯的抑制作用，而且隨著SB203580濃度的升高，抑制作用更加明顯，呈明顯的濃度依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 1 EGF可以引起p38MAPK磷酸化，在相同濃度EGF（100ng/ml）作用下，p38MAPK的磷酸化呈時(shí)間依賴性，最大磷酸化作用時(shí)間點(diǎn)為24h。
　　 2 相同濃度EGF（100ng/ml）可以明顯增強(qiáng)SEG-1細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)，呈時(shí)間依賴性