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文檔簡(jiǎn)介
1、食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma,EAC)發(fā)生率的增長(zhǎng)速度居各種癌腫的第二位,目前認(rèn)為Barrett食管(Barrett's Esophagus,BE)是食管腺癌的一種癌前病變,近年來(lái)的研究表明,BE的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì),并且由BE轉(zhuǎn)化而來(lái)的食管腺癌的發(fā)病率也明顯增加,亞洲國(guó)家的BE和食管腺癌雖不如西方國(guó)家常見(jiàn),但近年來(lái)的流行病學(xué)資料顯示也呈增加的趨勢(shì),食管腺癌早期即可發(fā)生淋巴和遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移,血管的形成
2、是促進(jìn)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和為腫瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)所必須的,但是在食管腺癌的發(fā)生發(fā)展中,新生血管形成的機(jī)制目前還不是十分清楚。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)家庭的一個(gè)成員,是腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生新生血管的最主要的細(xì)胞因子,是目前已知的最強(qiáng)的促進(jìn)血管生成的因子,VEGF在腫瘤組織中特異的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂和增殖,從而
3、促進(jìn)瘤體血管的新生,并加速腫瘤生長(zhǎng),提高血管通透性,使腫瘤細(xì)胞更易于侵入和穿透血管,實(shí)現(xiàn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。在食管腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中,VEGF在調(diào)節(jié)血管生成中起重要作用。食管腺癌中VEGF是高表達(dá)的,但VEGF是如何被激活的及激活的機(jī)制目前未見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。
絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)是細(xì)胞外各種信號(hào)從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。目前認(rèn)為,MA
4、PK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管發(fā)生及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用,其成員p38MAPK是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。越來(lái)越多的研究表明,VEGF在許多惡性腫瘤例如肝癌、食管鱗癌等中的表達(dá)與p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。
表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡,在組織損傷修復(fù)和腫瘤形成中發(fā)揮重要作用,而且還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移,與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移
5、密切相關(guān)。表皮生長(zhǎng)因子能與細(xì)胞膜上表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)結(jié)合使其磷酸化,再經(jīng)MAPK信號(hào)通路將信號(hào)傳遞至核內(nèi),促進(jìn)或抑制特定靶基因的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和運(yùn)動(dòng)。有研究表明,在多種腫瘤如食管癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、大腸癌等中EGF和VEGF均高表達(dá),并且兩者的表達(dá)呈正相關(guān);體外培養(yǎng)的多種細(xì)胞系中,EGF可通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤血管生成。在食管腺癌的發(fā)生發(fā)展中,是
6、否有EGF通過(guò)激活p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以致激活VEGF而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的相關(guān)資料未見(jiàn)報(bào)道。
本研究從EGF著手,通過(guò)對(duì)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異性阻斷,研究p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EGF誘導(dǎo)食管腺癌(SEG-1)細(xì)胞表達(dá)VEGF中的作用,探討食管腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中血管形成的機(jī)制。
目的:通過(guò)研究p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EGF誘導(dǎo)食管腺癌(SEG-1)細(xì)胞表達(dá)VEGF中的作用,探討食管腺癌細(xì)胞
7、轉(zhuǎn)移中血管形成的機(jī)制。
方法:采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)食管腺癌(SEG-1)細(xì)胞,以相同濃度EGF(100ng/ml)按不同的時(shí)間梯度刺激細(xì)胞,應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)VEGF mRNA,Western blot法測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)總p38MAPK、磷酸化p38MAPK、VEGF蛋白表達(dá)情況。并用p38MAPK特異抑制劑SB203580預(yù)處理細(xì)胞后,觀察上述指標(biāo)變化。
結(jié)果:
1 EGF對(duì)SEG-1細(xì)
8、胞p38MAPK蛋白表達(dá)的影響:Western blot結(jié)果顯示,大約在43KD位置出現(xiàn)p38MAPK特異性條帶。EGF作用于SEG-1細(xì)胞后p38MAPK磷酸化程度有所升高,且p38MAPK磷酸化程度隨EGF作用時(shí)間的變化而變化,1h、6h、12h、24h、48h的p38MAPK磷酸化的百分比分別為13.1%、31.2%、40.7%、53.5%、42.3%,可見(jiàn)24h的p38MAPK磷酸化水平最高,因此,認(rèn)為該時(shí)間點(diǎn)為p38MAPK最
9、大磷酸化時(shí)間點(diǎn)。
2 EGF對(duì)SEG-1細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響:RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA結(jié)果顯示:SEG-1細(xì)胞中有VEGF基因表達(dá),并且隨著EGF作用時(shí)間的延長(zhǎng),VEGFmRNA的表達(dá)水平逐漸上升,EGF作用于SEG-1細(xì)胞6h、12h、24h、48h后,VEGF mRNA表達(dá)分別為:0.494±0.034、0.728±0.067、0.948±0.046、0.806±0.059,與正常對(duì)照組(0
10、.357±0.011)相比,VEGF mRNA表達(dá)升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VEGF mRNA表達(dá)明顯升高后逐漸下降,于24h達(dá)高峰。Western blot檢測(cè)VEGF蛋白結(jié)果顯示:EGF刺激前SEG-1細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)量較低,刺激后1h開(kāi)始上升,持續(xù)至24h達(dá)最高,呈明顯的時(shí)間依賴性。EGF作用于SEG-1細(xì)胞1h后,VEGF蛋白表達(dá)為0.431±0.031,與正常對(duì)照組(0.390±0.028)相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p
11、>0.05)。EGF作用于SEG-1細(xì)胞6h、12h、24h、48h后,VEGF蛋白表達(dá)分別為:0.484±0.042、0.794±0.031、1.000±0.024、0.869±0.023,與正常對(duì)照組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
3 p38MAPK特異抑制劑SB203580處理SEG-1細(xì)胞:20μmol/L的SB203580可明顯抑制EGF誘導(dǎo)的p38MAPK激酶活力。SB203580對(duì)EGF誘導(dǎo)的SEG-1
12、細(xì)胞內(nèi)VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)亦有明顯的抑制作用,而且隨著SB203580濃度的升高,抑制作用更加明顯,呈明顯的濃度依賴性。
結(jié)論:
1 EGF可以引起p38MAPK磷酸化,在相同濃度EGF(100ng/ml)作用下,p38MAPK的磷酸化呈時(shí)間依賴性,最大磷酸化作用時(shí)間點(diǎn)為24h。
2 相同濃度EGF(100ng/ml)可以明顯增強(qiáng)SEG-1細(xì)胞VEGF mRNA和蛋白的表達(dá),呈時(shí)間依賴性
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