動物模型驗證CA916798基因通過PI3K-AKT通路參與順鉑耐藥.pdf

1、背景：
　　肺癌是當前世界上對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率已躍居各類惡性腫瘤的前列。多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)可導致腫瘤細胞對多種結構和作用機制不同的抗癌藥物產生耐受性,是肺癌化療失敗的主要原因之一。深入研究肺癌MDR的發(fā)生機制,有助于為臨床逆轉肺癌MDR提供新的治療靶點。
　　順鉑(cis-dichlorodiamine platinum,CDDP)是肺癌化療中有

2、效并廣泛使用的一線藥物,主要通過抑制腫瘤細胞DNA的合成[1]、誘導細胞發(fā)生凋亡[2]而發(fā)揮作用。肺癌細胞對順鉑的耐受是肺癌患者化療效果不盡人意的重要原因。目前研究認為,損傷修復過程中DNA剪切物的增加、抗凋亡、與調控信號通路相關的調節(jié)蛋白表達的改變、藥物攝取減少導致細胞內CDDP濃度降低等均可能與對順鉑的耐藥有關[1-5]。國內外研究發(fā)現(xiàn),肺癌細胞對化療藥物耐受的機制是一個多基因參與的復雜事件,而且不同的藥物誘導的肺癌MDR的機制不盡

3、相同[1,3-6],而到目前為止肺癌MDR的機制仍未完全闡明,因此,尋找新的耐藥相關基因并進行深入研究,有助于為臨床逆轉肺癌MDR提供新的治療靶點。
　　CA916798基因是我們課題組在前期研究工作中,通過抑制消減雜交(SSH)技術從人肺腺癌MDR細胞系SPC-A-1/CDDP中首先克隆表達的新基因,已登錄于GenBank的EST庫,并證實其與肺癌順鉑耐藥相關。前期研究發(fā)現(xiàn):CA916798基因高表達于肺癌耐藥細胞系;CA916

4、798基因的作用與PI3K/AKT信號轉導通路有密切關系:抑制PI3K、AKT或肺癌耐藥相關基因CA916798均可以逆轉多藥耐藥肺腺癌細胞A549/CDDP對CDDP的耐藥性,反之,激活AKT或增加CA916798基因的表達,則可以增強肺癌細胞對CDDP的耐受,初步證明肺癌耐藥相關基因CA916798很可能就是PI3K/AKT/mTOR信號通路作用的底物或靶點。本課題通過探討CA916798基因對順鉑的耐藥機制,為進一步明確CA916

5、798基因MDR機理進而尋找新的肺癌治療途徑奠定理論基礎。
　　目的:
　　在動物體內驗證PI3K/AKT/mTOR/P70S6K1信號通路和CA916798基因在肺癌順鉑耐藥中的作用以及它們之間的相互關系。
　　方法:
　　1.建立A549、A549/CDDP裸鼠移植瘤模型。
　　2.將裸鼠分為以下6組:A549組,A549/CDDP組,A549+LY294002組,A549/CDDP+LY294002組

6、,A549+LY294002+雷帕霉素組,A439/CDDP+LY294002+雷帕霉素組。
　　3.分別觀測加入順鉑、PI3K的抑制劑LY294002、mTOR的抑制劑雷帕霉素聯(lián)合LY294002后各組裸鼠的一般情況和腫瘤生長情況。
　　4.測量各組裸鼠腫瘤大小,進行腫瘤大體觀察、組織病理切片HE染色和免疫組化,檢測各組腫瘤組織中CA916798、AKT、mTOR、P70S6K1mRNA和蛋白的表達。
　　結果:

7、r>　　1.成功建立A549、A549/CDDP裸鼠移植瘤模型。
　　2.通過測量腫瘤大小及腫瘤大體觀察發(fā)現(xiàn):①A549/CDDP組移植瘤體積大于A549組;②用LY294002、雷帕霉素聯(lián)合LY294002阻斷PI3K/AKT通路后,A549組和A549/CDDP組移植瘤體積明顯縮小。
　　3.免疫組化結果表明:①A549/CDDP組腫瘤組織中CA916798、AKT、mTOR的蛋白表達量均高于A549組,p<0.05;②

8、經(jīng)LY294002或聯(lián)合雷帕霉素作用后,A549/CDDP組和A549組腫瘤組織中CA916798、AKT、mTOR的蛋白表達量下降,與對照組相比,p<0.05。
　　5.采用RT-PCR檢測各組A549和A549/CDDP腫瘤組織中CA916798、AKT、mTORmRNA表達,結果發(fā)現(xiàn):①A549/CDDP組的表達量均高于A549組,p<0.05;②用LY294002或聯(lián)合雷帕霉素作用后,A549組和A549/CDDP組的表達

9、量均下降,與對照組相比,p<0.05。
　　6.通過Western blot檢測證實:①A549/CDDP組CA916798、AKT、mTOR、P70S6K1的蛋白表達量均高于A549組,p<0.05;②采用LY294002或雷帕霉素聯(lián)合LY294002作用阻斷PI3K/AKT/mTOR通路后,A549組和A549/CDDP組CA916798、AKT、mTOR、P70S6K1的蛋白表達量均下降,與對照組比較,p<0.05。