重度營養(yǎng)不良大鼠生長激素-胰島素樣生長因子-1軸的變化及亮氨酸的調(diào)控作用.pdf

1、背景:在發(fā)展中國家的兒科病人、外科住院病人（特別是老年住院病人）以及腫瘤病人當(dāng)中普遍存在蛋白質(zhì)能量營養(yǎng)不良。蛋白質(zhì)能量營養(yǎng)不良可導(dǎo)致患者對治療反應(yīng)差、手術(shù)后傷口愈合延遲、免疫功能降低、感染性和非感染性并發(fā)癥增加、住院時間延長以及病死率增加等不良的臨床預(yù)后。當(dāng)患者伴有惡性營養(yǎng)不良或蛋白質(zhì)能量嚴重缺乏時，可導(dǎo)致機體生長功能受損，并且這種生長限制可能與患者的營養(yǎng)底物缺乏以及集體的代謝異常有關(guān)，其中血清IGF-1的水平降低，而血清GH水平升高尤

2、為突出。
　　人體生長激素是由下丘腦腺垂體前葉細胞合成與分泌，分子量大小為22kDa的肽鏈蛋白。生長素和下丘腦生長激素釋放激素(GHRH)可誘發(fā)其合成分泌，并且可通過生長抑素和胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)負反饋作用抑制其合成分泌。GH的分泌釋放一般是脈沖式的，特別是在夜間睡眠時，然而其分泌量的高低受到年齡、性別、疾病以及患者的營養(yǎng)狀況的影響。同時GH可以調(diào)節(jié)血清IGF-1的產(chǎn)量，并且GH和IGF-1可以共同刺激骨骼肌的生長。

3、IGF-1是胰島素超家族的一員，發(fā)現(xiàn)其最初的作用是作為GH促進體細胞生長調(diào)節(jié)的介質(zhì)，隨后又發(fā)現(xiàn)IGF-1具有調(diào)節(jié)細胞分解代謝、細胞分化和存活等作用。IGF-1主要由肝臟組織合成，在血液和其他體液組織中主要與IGFBPs結(jié)合成復(fù)合物的形式存在。機體中IGF-1的含量受到多種因素的影響，其中營養(yǎng)狀況是調(diào)節(jié)循環(huán)和組織中IGF-1的關(guān)鍵因素。食物中蛋白質(zhì)的含量和能量的攝入量可以影響血清IGF-1的含量。在限制能量的攝入時（如短時間的禁食和營養(yǎng)不

4、良等）可以導(dǎo)致血清IGF-1水平的明顯減低和尿氮丟失量的增加。因此，進一步表明IGF-1在機體中有促進蛋白合成作用。
　　IGF-1的合成量依賴于能量和氨基酸的有效供給。其中亮氨酸可啟動PI3K-Akt信號合成通路，從而激活細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)啟動蛋白質(zhì)翻譯的起始。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷失血性休克復(fù)蘇后大鼠模型中，富含亮氨酸的高蛋白腸內(nèi)營養(yǎng)可以促進IGF-1的合成。靜脈輸注或攝入亮氨酸可以迅速促進機體蛋白質(zhì)的合成率增加。但是，很少

5、有研究長時間亮氨酸補充是否對重度營養(yǎng)不良個體GH-IGF-1軸系統(tǒng)變化有何影響。
　　因此，我們的研究目的是探索長時間給予不同劑量的亮氨酸是否可以調(diào)節(jié)重度營養(yǎng)不良大鼠GH-IGF-1軸系統(tǒng)的功能和m-TOR相關(guān)信號傳導(dǎo)通路在重度營養(yǎng)不良大鼠骨骼肌的合成中作用。
　　目的:一、本研究通過建立重度蛋白質(zhì)能量營養(yǎng)不良大鼠模型，模擬臨床營養(yǎng)不良患者的代謝異常狀態(tài)，觀察營養(yǎng)不良狀態(tài)下GH-IGF-1系統(tǒng)的變化，以及探討營養(yǎng)不良導(dǎo)致獲得

6、性生長激素抵抗的機制。
　　二、在蛋白質(zhì)能量營養(yǎng)不良大鼠模型上，進一步探索長時間給予不同劑量的亮氨酸是否可以調(diào)節(jié)重度營養(yǎng)不良大鼠GH-IGF-1系統(tǒng)的功能和m-TOR相關(guān)信號通路在重度營養(yǎng)不良大鼠骨骼肌合成中的作用，為臨床上營養(yǎng)不良合并生長激素抵抗患者的干預(yù)治療提供理論依據(jù)。
　　方法:1.1 第一部分，將健康的雄性SD大鼠給予標準的美國實驗大鼠飼料(AIN-93M)飲食。在溫度為23±2℃，相對濕度為55±10％和12小時

7、明暗交替的環(huán)境中單籠飼養(yǎng)，自由攝食，自由飲水適應(yīng)2周。在新環(huán)境的適應(yīng)階段，每天記錄大鼠的平均攝食量可作為大鼠食物限制階段日常攝食量。隨后把大鼠隨機分為二組，正常對照組（CON組，共10只）和營養(yǎng)不良組（M組，共10只）。正常對照組:單籠飼養(yǎng)普通飲食4周;營養(yǎng)不良組:單籠飼養(yǎng)50％普通飲食量4周。實驗期間所有大鼠自由飲水。4周后腹腔麻醉下處死大鼠收集組織和血液標本。
　　1.2 統(tǒng)計方法:采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0中文版對相關(guān)數(shù)據(jù)

8、進行統(tǒng)計學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)采用均值±標準差(x±s)。兩組間的差異采用獨立樣本t檢驗法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.1 第二部分:將健康的雄性SD大鼠給予標準的美國實驗大鼠飼料(AIN-93M)飲食。在溫度為23±2℃，相對濕度為55±10％和12小時明暗交替的環(huán)境中單籠飼養(yǎng)，自由攝食，自由飲水適應(yīng)2周。在新環(huán)境的適應(yīng)階段，每天記錄大鼠的平均攝食量可作為大鼠食物限制階段日常攝食量。隨后把大鼠隨機分為四組，正常對照組（

9、CON組，共10只，單籠飼養(yǎng)普通飲食6周）;營養(yǎng)不良普通飲食組(M-CON組，共10只，先經(jīng)歷單籠飼養(yǎng)50％普通飲食量4周的體重減輕階段，然后在恢復(fù)普通飲食2周）;營養(yǎng)不良低劑量亮氨酸組(M-L組，共10只，先經(jīng)歷單籠飼養(yǎng)50％普通飲食量4周的體重減輕階段，然后在恢復(fù)普通飲食和低劑量亮氨酸灌胃2周[0.675g/kg亮氨酸]）和營養(yǎng)不良高劑量亮氨酸組(M-H組，共10只，先經(jīng)歷單籠飼養(yǎng)50％普通飲食量4周的體重減輕階段，然后在恢復(fù)普通飲

10、食和高劑量亮氨酸灌胃2周[1.35g/kg亮氨酸]）。實驗期間所有大鼠自由飲水。6周后腹腔麻醉下處死大鼠收集組織和血液標本。
　　2.2. 統(tǒng)計方法:采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0中文版對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)均采用均值±標準差(x±s)表示。多組之間相比采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。假如方差不齊，使用Dunnett T3法檢測多組間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:第一部分結(jié)

11、果:
　　1.大鼠血清GH、IGF-1、IGFBP-1和IGFBP-3的水平
　　與對照組相比，營養(yǎng)不良組大鼠血清GH和IGFBP-1水平明顯升高，并且兩組之間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)。
　　與對照組相比，營養(yǎng)不良組大鼠血清IGF-1和IGFBP-3水平明顯降低，并且差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　2.Western Blot結(jié)果
　　與對照組相比，營養(yǎng)不良組大鼠骨骼肌組織中磷酸化的

12、Akt、mTOR和S6K1水平明顯降低，且差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　與對照組相比，營養(yǎng)不良組大鼠肝組織GHR表達水平明顯減少，且差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　3.大鼠肝組織GHR、IGF-1、IGFBP-1和IGFBP-3mRNA相對表達量
　　與對照組相比，營養(yǎng)不良組大鼠肝組織GHR、IGF-1和IGFBP-3mRNA相對表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。

13、　　與對照組相比，營養(yǎng)不良組大鼠肝組織IGFBP-1 mRNA相對表達水平明顯增加，且差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　第二部分結(jié)果:
　　1.大鼠血清GH、IGF-1、IGFBP-1和IGFBP-3的水平
　　與CON組相比，M-CON組、M-L組和M-H組大鼠血清中的GH水平都明顯降低，且各組間無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　與CON組相比，M-CON組大鼠血清IGF-1水平明顯減少，且兩組之

14、間有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)。大鼠血清IGF-1水平，在M-L組、M-H組和CON組間，無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　與CON組相比，其余三組大鼠血清IGFBP-1水平有不同程度的升高。但是與M-CON組相比，M-L和M-H組大鼠血清IGFBP-1水平明顯降低，且差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　與CON組相比，其余三組大鼠血清IGFBP-3水平明顯減少，并且差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意思(p＜0.01)。但是M

15、-L和M-H組大鼠血清IGFBP-3含量較M-CON組明顯增加，并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　2.Western Blot結(jié)果
　　與CON組、M-L組和M-H組相比，M-CON組大鼠骨骼肌組織中磷酸化的Akt、mTOR和S6K1水平明顯降低(p＜0.01)。而其余各組間統(tǒng)計學(xué)差別(p＞0.05)。
　　與CON組、M-L組和M-H組相比，M-CON組大鼠肝組織GHR水平明顯降低，(p＜0.01)。而其余

16、各組間統(tǒng)計學(xué)差別(p＞0.05)。
　　3.大鼠肝組織GHR、IGF-1、IGFBP-1和IGFBP-3mRNA相對表達量
　　與CON組、M-L組和M-H組相比，M-CON組大鼠肝組織GHRmRNA相對表達水平明顯降低(p＜0.01)。而其余各組間統(tǒng)計學(xué)差別((p＞0.05)。
　　與CON組相比，M-CON組和M-H組大鼠肝組織IGF-1mRNA相對表達水平明顯減少(p＜0.01)。
　　與CON組相比，M-

17、CON組IGFBP-1mRNA相對表達水平都有明顯增加(p＜0.01)。
　　與CON組比較，其余三組大鼠肝組織IGFBP-3mRNA相對表達水平有不同程度的減少。與其他各組相比，M-CON組大鼠肝組織IGFBP-3mRNA相對表達水平下降最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　4.大鼠體重的變化
　　M-CON、M-L和M-H組大鼠在4周限制性飲食階段體重逐漸減輕。重新恢復(fù)自由飲食加干預(yù)治療后，三組大鼠體重均

18、快速增加，并且三組間體重差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　5.大鼠骨骼肌濕重的變化
　　與其他組相比，M-CON組大鼠骨骼?。枘c肌、比目魚肌和趾長伸?。裰刈钶p，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。而其余各組間幾乎無明顯差異。
　　結(jié)論1.營養(yǎng)不良導(dǎo)致的獲得性生長激素抵抗的機制是多種原因所致的。
　　2.長期亮氨酸的補充可調(diào)節(jié)下游Akt-mTOR合成信號傳導(dǎo)促進營養(yǎng)不良大鼠骨骼肌蛋白的合成。
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