AAPH誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對(duì)胚胎成骨的影響.pdf

1、研究已證明氧化應(yīng)激與胚胎發(fā)育不良有著密切聯(lián)系，骨骼系統(tǒng)的發(fā)育是胚胎發(fā)育的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，然而關(guān)于氧化應(yīng)激與胚胎骨骼發(fā)育的關(guān)系研究還報(bào)道尚少。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)高劑量自由基誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致胚胎肢芽發(fā)育畸形，本文將進(jìn)一步深入探討氧化應(yīng)激對(duì)胚胎骨生成的影響與作用機(jī)制。
　　首先，我們給予雞胚不同濃度的AAPH（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/egg）建立氧化應(yīng)激雞胚模型。給予AAPH處理后，雞胚孵育至

2、12.5天，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，確定建立慢性氧化應(yīng)激雞胚模型的最佳劑量。結(jié)果顯示，雞胚的死亡率和畸形率隨著AAPH濃度的增加而增加，AAPH對(duì)雞胚的半數(shù)致死劑量為4.8μmol/egg。不同濃度的AAPH（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/egg）均能造成雞胚氧化應(yīng)激，例如骨骺軟骨細(xì)胞ROS生成速率增高，線粒體膜電位降低。我們確定0.5μmol/egg的AAPH作為建立慢性氧化應(yīng)激雞胚模型的劑量，在此劑量下雞胚長(zhǎng)骨長(zhǎng)度

3、較正常組相比顯著性縮短。
　　其次，我們以AAPH（0.5μmol/egg）建立的氧化應(yīng)激雞胚模型為基礎(chǔ)，探討氧化應(yīng)激對(duì)胚胎軟骨內(nèi)成骨的影響，為此依次進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)：（1）連續(xù)取16.5、17.5、18.5天雞胚長(zhǎng)骨進(jìn)行阿利新藍(lán)&茜素紅雙染，測(cè)量脛骨和股骨長(zhǎng)度，檢測(cè)氧化應(yīng)激對(duì)雞胚長(zhǎng)骨生長(zhǎng)速度的影響。結(jié)果顯示，AAPH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激能顯著性減緩雞胚長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)速度，縮短長(zhǎng)骨長(zhǎng)度。（2）連續(xù)取16.5、17.5、18.5天雞胚長(zhǎng)骨進(jìn)行石

4、蠟切片，H&E染色處理，分別測(cè)量其脛骨、股骨骨骺端軟骨細(xì)胞增殖區(qū)和軟骨細(xì)胞膨大區(qū)的長(zhǎng)度，檢測(cè)氧化應(yīng)激對(duì)雞胚長(zhǎng)骨軟骨內(nèi)成骨的兩個(gè)關(guān)鍵步驟—軟骨細(xì)胞增殖和軟骨細(xì)胞膨大的影響。結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激顯著性縮短了雞胚長(zhǎng)骨骨骺端軟骨細(xì)胞增殖區(qū)和膨大區(qū)的長(zhǎng)度，導(dǎo)致雞胚長(zhǎng)骨軟骨細(xì)胞增殖速度減慢，軟骨細(xì)胞膨大骨化速度降低。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)雞胚長(zhǎng)骨骨骺軟骨增殖區(qū)軟骨細(xì)胞總數(shù)減少，正處于分裂期的細(xì)胞數(shù)下降。（3）采用Micro-CT術(shù)檢測(cè)雞胚發(fā)育后期長(zhǎng)骨的相關(guān)骨指標(biāo)

5、，驗(yàn)證氧化應(yīng)激導(dǎo)致的胚胎骨發(fā)育不良。結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激顯著性降低了雞胚長(zhǎng)骨的骨量和骨密度，導(dǎo)致胚胎不良的骨生成。（4）采用RT-PCR術(shù)檢測(cè)軟骨內(nèi)成骨的關(guān)鍵調(diào)控因子Sox9和Runx2以及相關(guān)基因Type II collagen和Aggrecan的基因表達(dá)。結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激顯著性降低了這些基因的表達(dá)水平。
　　綜上所述，AAPH（0.5μmol/egg）誘導(dǎo)的慢性氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致胚胎長(zhǎng)骨Sox9的表達(dá)下降，從而下調(diào)了Type II

6、 collagen和Aggrecan的表達(dá)，影響了軟骨細(xì)胞的生存、營(yíng)養(yǎng)和代謝，抑制了軟骨細(xì)胞的增殖，減緩了長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)發(fā)育速度。AAPH氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的Sox9蛋白量表達(dá)下降，會(huì)直接導(dǎo)致預(yù)膨大軟骨細(xì)胞中磷酸化Sox9蛋白的減少，導(dǎo)致預(yù)膨大軟骨細(xì)胞直接進(jìn)入終末分化階段，發(fā)生凋亡，大大減少了成熟膨大軟骨細(xì)胞的數(shù)量，造成Runx2表達(dá)的降低，導(dǎo)致長(zhǎng)骨的骨化不良、骨量和骨密度降低。本研究結(jié)果闡明了氧化應(yīng)激對(duì)胚胎骨生成的影響，并初步揭示了具有臨床代表