神經(jīng)干細(xì)胞治療帕金森病的實驗研究.pdf

1、第一部分帕金森病大鼠模型激發(fā)自體腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的實驗研究 目的通過制作帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)大鼠模型，研究PD大鼠激發(fā)自體腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化情況。方法將6-OHDA注入紋狀體內(nèi)制作PD大鼠模型(分2組)。第1組模型選取相應(yīng)的時間點處死，處死前均注射5-溴脫氧尿苷(Brdu)。免疫組織化學(xué)方法動態(tài)檢測Brdu和巢蛋白(Nestin)的表達(dá)。Brdu標(biāo)記方法確定腦內(nèi)增殖細(xì)胞，Nest

2、in的表達(dá)用于確定腦內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞，Brdu/Nestin免疫雙標(biāo)確定腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況。第2組模型連續(xù)注射Brdu7天后處死，分別用Brdu/NeuN、Brdu/GFAP標(biāo)記增殖的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化情況。結(jié)果同正常組、假手術(shù)組比較，PD模型大鼠損傷側(cè)的海馬區(qū)，側(cè)腦室室管膜下區(qū)和黑質(zhì)區(qū)的Brdu+細(xì)胞，Nestin+細(xì)胞和Brdu+/Nestin+細(xì)胞數(shù)在模型成功后的第3、5、7天明顯增加，14天后逐漸減少，2

3、8天后恢復(fù)到正常水平。PD模型成功后7天，在以上腦區(qū)Brdu+/GFAP+、Brdu+/NeuN+細(xì)胞開始出現(xiàn)，14天后雙標(biāo)的陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，28天后達(dá)到高峰。在這些雙標(biāo)的細(xì)胞中，Brdu+/GFAP+的細(xì)胞數(shù)量較多，Brdu+/NeuN+的細(xì)胞數(shù)量較少。結(jié)論6-OHDA紋狀體內(nèi)注射制作的PD大鼠模型能夠激活自體神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并且增殖的細(xì)胞大部分分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，少部分分化為神經(jīng)元。 第二部分神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合GDNF

4、腦內(nèi)移植治療帕金森病的實驗研究 目的探討GDNF對腦內(nèi)移植的神經(jīng)干細(xì)胞的存活、分化及對PD大鼠的治療作用。方法用無血清的培養(yǎng)技術(shù)將E14.5胚胎大鼠腹側(cè)中腦組織制備成單細(xì)胞懸液，接種到含有表皮生長因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblastgrowthfactor-basic,bFGF)、B27(B27suplement)的DMEM/F12(1∶1)的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)

5、，待形成原代克隆球后，用有限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆和傳代擴增，以獲得大量來源相同的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球。并且進(jìn)行Brdu和Nestin的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。將PD大鼠模型隨機分成三組，分別向吻側(cè)紋狀體內(nèi)注入生理鹽水、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞+GDNF，移植的細(xì)胞為傳第3代、濃度為0.5x105細(xì)胞/μl。移植后取不同的時間點(7天、14天、21天、30天、60天)檢測PD大鼠模型旋轉(zhuǎn)行為的改變。并且在移植后行HE染色、Brdu和TH免疫組化，觀察

6、移植細(xì)胞的存活和分化情況。在30天，60天時，用高效液相色譜檢測移植后的大鼠腦紋狀體DA含量的變化。結(jié)果1、E14.5胚胎大鼠腹側(cè)中腦組織細(xì)胞培養(yǎng)兩周后可以形成較多的懸浮生長的神經(jīng)球，經(jīng)單細(xì)胞克隆和傳代擴增后得到大量的同源細(xì)胞克隆球。經(jīng)過Brdu和Nestin的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測90％以上的細(xì)胞呈陽性。2、細(xì)胞移植后前3周，各組大鼠的旋轉(zhuǎn)行為無明顯變化；第30天和60天時，檢測發(fā)現(xiàn)其旋轉(zhuǎn)行為有較為明顯的改善(較對照組，P＜0.05)，并且

7、加入GDNF組的大鼠旋轉(zhuǎn)行為改善較單純移植神經(jīng)干細(xì)胞組效果更為明顯(較前兩組，P＜0.05)；3、HE染色顯示移植后一天，移植細(xì)胞呈簇狀或串狀沿針道分布，細(xì)胞數(shù)量較多。4、Brdu染色：Brdu+細(xì)胞胞核深染呈深黃褐色，大多數(shù)細(xì)胞較小，無突起，呈圓形，橢圓形、少數(shù)呈多邊形或不規(guī)則形態(tài)。細(xì)胞主要分布在移植區(qū)域。隨著移植時間的推移，Brdu+細(xì)胞數(shù)量越來越少。5、TH染色：從第14天起，開始出現(xiàn)TH+神經(jīng)元(5-6個/視野)，細(xì)胞呈圓形或橢

8、圓形，胞漿棕黃色，無明顯突起，分布在針道與紋狀體實質(zhì)的交界處：在第30大，在針道的兩側(cè)TH+神經(jīng)元增多(8-10個/視野)，有的TH+神經(jīng)元可見少許突起。NSCs移植組也可見少量分化為TH+神經(jīng)元的DA能神經(jīng)元。但與GDNF+NSCs移植組相比，NSCs移植組誘導(dǎo)分化為TH+神經(jīng)元的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。6、高效液相色譜檢測：在第30天和60天，與PD模型相比，NSCs移植組大鼠紋狀體DA的含量有不同程度的增加，但GDNF+NSCs組的增加