人源S100A4蛋白的功能表達及單抗制備.pdf

1、目的:
　　本研究采用全基因合成法，PCR（polymerase chain reaction)合成S100A4基因片段。構(gòu)建表達人源S100A4蛋白的重組質(zhì)粒，并使之高效表達，再以純化后獲得的人源S100A4蛋白免疫Balb/c小鼠，從而制備穩(wěn)定分泌抗人S100A4單克隆抗體（mAb）的雜交瘤細胞系，并對其分泌的mAb進行性質(zhì)鑒定。
　　方法:
　　1.采用全基因合成法，PCR合成S100A4基因片段。并根據(jù)大腸桿菌

2、密碼子偏好性，利用Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GeneBank中檢索到的人源S100A4基因序列，全部選用偏好密碼子設(shè)計合成S100A4序列引物。通過雙酶切、膠回收純化、連接后得到pET32a-S100A4重組載體。
　　2.將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thingalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)后表達的重組蛋白再經(jīng)離子交換層析純化。<

3、br>　　3.用免疫印跡(Western-blot)法檢測重組蛋白的抗原活性，腫瘤細胞侵襲及遷移實驗驗證重組蛋白生物活性。
　　4.用純化后獲得的人源S100A4重組蛋白免疫Balb/c小鼠，利用雜交瘤細胞融合技術(shù)制備抗人S100A4的mAb。
　　5.對mAb進行性質(zhì)鑒定，包括用Western-blot及交叉試驗鑒定mAb的特異性，用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，

4、ELISA)檢測mAb腹水效價及mAb的親和力等。
　　結(jié)果:
　　1.合成了人源S100A4基因全長，并成功構(gòu)建人源S100A4蛋白表達載體pET32a-S100A4，經(jīng)酶切鑒定及測序證明基因序列完全一致。
　　2.成功進行了人源S100A4蛋白的誘導(dǎo)表達、純化及鑒定，其純度達到95％以上。Western-blot結(jié)果顯示非常清晰的免疫印跡條帶，表明重組蛋白具有免疫學(xué)特異性。腫瘤細胞侵襲及遷移實驗顯示人源S100A4

5、蛋白具有生物活性。
　　3.經(jīng)免疫小鼠、細胞融合后獲得6株能穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細胞系，Western-blot分析顯示，該mAb能與具有生物學(xué)活性的人源S100A4蛋白結(jié)合。成功制備鼠抗人S100A4蛋白單克隆抗體，腹水mAb效價可達204800。6株單抗的親和常數(shù)均達到108以上，表明抗原與抗體結(jié)合的緊密程度較高。交叉實驗結(jié)果顯示6株單抗均具有較高的特異性，符合制備單克隆抗體的要求。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了

6、人源S100A4基因重組克隆質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定、PCR特異性鑒定和序列比對分析證實為目的基因。
　　2.原核表達系統(tǒng)可高效表達重組人源S100A4蛋白。經(jīng)離子交換層析純化后可獲得高純度目的蛋白。腫瘤細胞侵襲及遷移實驗顯示人源S100A4蛋白具有生物活性。
　　3.成功建立了能穩(wěn)定分泌單抗的6株雜交瘤細胞系，制備出鼠抗人 S100A4蛋白的單克隆抗體，并對其性質(zhì)進行了鑒定，為進一步用于人源S100A4的臨床檢測和實驗研究創(chuàng)造了條