參芪水提液純化技術篩選研究.pdf

1、目的：以參芪扶正方為研究對象，應用醇沉工藝、澄清劑絮凝、大孔樹脂和葡聚糖凝膠吸附純化等技術對其水提液進行單用和聯(lián)用純化研究，篩選最佳純化工藝，為參芪水提液純化以及參芪注射液產(chǎn)品質量提升奠定了良好的基礎和依據(jù)。
　　 方法：采用紫外分光光度法測定總皂苷和總糖含量；采用高效液相-紫外-蒸發(fā)光聯(lián)合技術建立黃芪甲苷、芒柄花素含量測定方法和指紋圖譜分析方法；采用薄層色譜法進行鑒別和分析。以沉淀量為指標，對殼聚糖、ZTC1+1Ⅲ型澄清劑，果

2、汁澄清劑等澄清劑進行研究，篩選最佳澄清劑。以總皂苷、總糖和黃芪甲苷、芒柄花素含量為指標，分別采用正交法對殼聚糖澄清法、殼聚糖-乙醇聯(lián)用技術、大孔樹脂-葡聚糖凝膠聯(lián)用技術以及醇沉法進行研究，輔以純化液固含物量和指紋圖譜分析，篩選參芪水提液的最佳純化工藝。
　　 結果：
　　 1.含量測定方面研究表明：總糖以吸光度(Y，A)對濃度(X，mg/mL)進行線性回歸，得標準曲線方程：Y=10.905X+0.1394；r=0.999

3、 8，總糖在0.08～0.24 mg范圍內(nèi)呈線性關系；總皂苷以吸光度(Y，A)對黃芪甲苷毫克數(shù) (X，mg)繪制標準曲線，線性方程為：Y=2.3409 X＋0.0252，R=0.999 6，黃芪甲苷在0.031～0.188 mg范圍內(nèi)呈線性關系；黃芪甲苷以峰面積的對數(shù)與進樣量的對數(shù)做標準曲線，得標準曲線為Y=1.3351X+2.3674，r=0.999 8，表明黃芪甲苷進樣量在0.057μg～1.14 μg范圍內(nèi)呈良線性關系好；芒柄花素

4、以峰面積對進樣量做標準曲線，得標準曲線為Y=5152.3X-101.39，r=0.999 9，表明芒柄花素進樣量在0.026 μg～0.416μg范圍內(nèi)呈良好線性關系。
　　 2.指紋圖譜分析方法研究表明：以水提液為研究對象，以乙腈和水為流動相通過梯度洗脫，分別以芒柄花素和黃芪甲苷為指標，在254 nm紫外光譜圖中共分離出11個主要色譜峰，11號峰為芒柄花素；在蒸發(fā)光圖譜中共分離出12個主要峰，6號峰為黃芪甲苷；各峰分離度好、塔

5、板數(shù)均在5000以上，基線平整，經(jīng)方法學考察，各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積比值的RSD均小于1.4[％]。
　　 3.不同澄清劑篩選研究表明：藥液濃度和澄清劑加入量對沉淀量有較多影響，以殼聚糖所得沉淀量最高，澄清效果要優(yōu)于ZTC1+1和101果汁澄清劑。
　　 4.殼聚糖研究表明：加入量對參芪水煎液中黃芪甲苷、總糖和皂苷總含量具有顯著影響；加入量和絮凝溫度對芒柄花素含量存在顯著性差異。綜合分析得最佳工藝為A2B2

6、C2D1，該工藝總皂苷與總糖的含量達51.70[％]，芒柄花素含量達0.02614[％]，黃芪甲苷含量達0.1907[％]。固含物量40.29 mg/mL。HPLC-UV-ELSD指紋圖譜和TLC分析表明，不同工藝樣品中出峰個數(shù)和斑點數(shù)基本一致，但在含量上存在一定差異。
　　 5.水提醇沉工藝研究表明：醇沉法芒柄花素含量可達0.025[％]，黃芪甲苷含量可達0.16[％]，總皂苷與總糖的含量可達50.89[％]，固含物量36.9

7、5 mg/mL，且蒸發(fā)光圖譜顯示5～10min之間峰分離 度較好，噪音小，基線較平。
　　 6.殼聚糖-乙醇、大孔樹脂-葡聚糖凝膠聯(lián)用技術研究表明：加入少量乙醇對殼聚糖沉淀效果具有一定的促進作用，固含物低于醇沉法；以大孔樹脂吸附總皂苷黃酮類和葡聚糖凝膠法分離總糖類，其純化效果明顯提高，所得純化樣品中固含物較少，所含皂苷黃酮類、總糖類、芒柄花素和黃芪甲苷的含量均較高，其中芒柄花素含量可達0.03960[％]；黃芪甲苷含量可達0.4

8、83[％]；總皂苷與總糖的含量可達74.82[％],固含物量16.17 mg/mL。通過HPLC指紋圖譜分別比較了不同純化工藝的紫外和蒸發(fā)光指紋圖譜可知，不同純化技術的HPLC指紋圖譜整體面貌與參芪水提液基本保持相似，但以大孔樹脂-葡聚糖凝膠聯(lián)用技術分離出的峰多，基線較平，雜質所造成的噪音較小；254nm紫外圖譜中共分離出16個信息峰，16號峰為芒柄花素，蒸發(fā)光指紋圖譜共分離出14個信息峰，14號峰為黃芪甲苷。TLC分析表明，以V二氯甲

9、烷:V甲醇:V水(13:9:2)為展開劑，可以得到較多斑點，而且分離度好，各不同純化方法的薄層色譜中斑點的大小和顏色存在差異，表明不同工藝對成分純化具有一定影響。
　　 結論：
　　 1.通過方法學考察，總糖和皂總苷紫外分光光度法精密度、穩(wěn)定性、重復性均達到要求，可用于測定參芪中總糖、總皂苷含量。建立的芒柄花素、黃芪甲苷含量測定以及指紋圖譜分析的HPLC-UV-ELSD方法，其精密度、穩(wěn)定性、重復性均達到要求，可用于參芪

10、HPLC指紋圖譜分析水提液及純化液的成分變化，能從整體上對參芪純化前后各成分的變化情況進行分析，比較不同純化工藝對參芪水提液的影響。建立的TLC圖譜可用于分析水提液及純化液的成分變化，比較不同純化工藝對參芪水提液的影響。
　　 2.單用和聯(lián)用純化方法表明，殼聚糖澄清法具有較好的沉淀效果，且加入少量乙醇能明顯提高沉淀速度和沉淀量；水提醇沉具有良好的沉淀效果，但有效部位多糖也被大量除去，不利于更好的發(fā)揮制劑療效；采用大孔樹脂分離皂苷