鎘對蛋白磷酸酶2C的內皮細胞的作用及機制研究.pdf

1、研究背景及意義：
　　動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要發(fā)病原因。動脈粥樣硬化的原因非常復雜，內皮功能障礙、細胞凋亡、血脂異常、炎性細胞浸潤、脂質沉積、氧化應激、膠原代謝異常、血管生成等因素均在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起作用。其中，內皮功能障礙在動脈粥樣硬化的早期階段發(fā)揮了主要的作用。所以，維持內皮的正常功能對于預防動脈粥樣硬化有重大的意義。
　　重金屬離子鎘(Cadmium，Cd)是一種不可降解的污染物，嚴重危害人體健康。

2、環(huán)境中的鎘不能被生物降解，導致含量逐年上升，被某些植物攝取而進入食物鏈。人類從食物、水、空氣和土壤中接觸鎘，鎘極易在體內蓄積，半衰期長達10-30年，對心血管系統(tǒng)、腎臟、肝臟、肺及睪丸等器官系統(tǒng)產生一系列損害。環(huán)境中的鎘進入人體后會沉積在心臟和血管，心血管系統(tǒng)是鎘毒性作用的靶器官之一。實驗證據(jù)表明鎘對動脈粥樣硬化的起始有一定作用并能促進其發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，鎘能導致內皮功能障礙，加速動脈粥樣斑塊形成;能增加活性氧的形成，通過結合金屬硫蛋白干

3、擾氧化應激反應。另外，鎘也可以通過升高血壓、腎臟損傷、鎘相關的雌激素活性改變或表觀遺傳變化來影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。鎘毒性的機制很復雜，主要包括抑制鋅指蛋白的功能、調節(jié)細胞內鈣信號、改變活性氧、抑制DNA修復等。但是這些機制與鎘誘導的動脈粥樣化形成的相關性還不甚明確。
　　在蛋白質的翻譯后修飾中，可逆性蛋白磷酸化/去磷酸化的調節(jié)需要蛋白激酶和蛋白磷酸酶的共同參與，這一過程參與了幾乎所有細胞功能的調控，包括細胞生長、免疫應答及細

4、胞代謝等。人類蛋白磷酸酶家族包括大約100種酪氨酸磷酸酶(protein tyrosinephos phatase，PTP)和40種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，后者需要金屬離子激活一個水分子來實施其去磷酸化的作用。蛋白磷酸酶2C(proteinphosphatase2C，PP2C)，即Mn2+/Mg2+依賴性蛋白磷酸酶(proteinphosphatasemagnesium/manganium-dependent，PPM)，二價金屬離子與其結

5、合后可以發(fā)揮激活或抑制其磷酸酶活性的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物中PP2C家族的16種基因至少編碼了22種亞型。這些蛋白在調節(jié)應激信號通路、信使RNA前體的剪接、蛋白泛素化和降解、細胞代謝以及細胞死亡/存活信號通路中起著重要的作用。PPM1A，亦稱PP2Cα，是PP2C家族中最具代表性的成員，在幾乎所有的組織都有表達，參與了很多重要信號通路的調節(jié)。已報道PPM1A可以去磷酸化腺苷活化蛋白激酶，進而抑制其活化，在保證心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)中起了

6、重要作用。PPM1A是絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路中重要的負調控因子，可抑制c-jun氨基末端激酶(c-junN-terminalkinase，JNK)和p38MAPK的活化。作為PP2C家族的典型代表，PPM1A可被Mn2+、Mg2+、Fe2+等激活，可被Ca2+抑制，但能否被Cd2+抑制仍不清楚。以往研究表明，長期接觸Cd2+會降低蛋白磷酸酶5和蛋白磷酸酶

7、2A的A亞基的蛋白水平，但是Cd2+是否是通過直接結合蛋白激酶或蛋白磷酸酶來調節(jié)蛋白的磷酸化水平還未曾進行過深入的研究。進一步研究Cd2+與磷酸酶的相互作用，對于治療鎘對機體的毒性包括鎘對動脈粥樣硬化的促進，具有重要意義。
　　整個論文分為三大部分，第一部分，我們研究了不同金屬離子對PP2C家族的作用，發(fā)現(xiàn)Cd2+可以特異而有效地抑制PPM1A和PPM1G，抑制常數(shù)Ki小于1μM;第二部分，我們重點探討了Cd2+對PPM1A和PP

8、M1G的抑制作用及機制，發(fā)現(xiàn)Cd2+是通過作用于PP2C的M1金屬離子結合位點發(fā)揮抑制作用的;第三部分，我們發(fā)現(xiàn)低濃度的Cd2+可以在一定程度上抑制PPM1A引起的人臍靜脈內皮細胞的凋亡，而高濃度的Cd2+可以通過氧化應激導致細胞凋亡，對進一步探討Cd2+與動脈粥樣化發(fā)生發(fā)展的關系具有重要意義。
　　第一部分：金屬離子對蛋白磷酸酶2C的作用
　　研究目的：
　　探討二價金屬離子對PP2C磷酸酶家族的作用。
　　研

9、究方法：
　　1.質粒構建與蛋白純化
　　將PPM1A、PPM1G野生型序列亞克隆到pet30a原核表達載體上，通過Ni-NTA親和層析進行蛋白純化。
　　2.酶動力學研究
　　(1)對小分子底物磷酸對硝基苯酯(p-nitrophenylphosphate，pNPP)的磷酸酶活力測定:分別在Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Zn2+、Hg2+、Ca2+、Sr2+、Cr2+、Ba2+和Li

10、+存在的條件下，測定PPM1A或PPM1G對pNPP的去磷酸化活性。
　　(2)對ppERK短肽、pp38短肽磷酸酶活力:短肽作為底物，Mn2+作為激活劑，Cd2+作為抑制劑。
　　(3)對體外純化pERK2蛋白的磷酸酶活力:磷酸化pERK2蛋白作為底物，Mn2+作為激活劑，Cd2+作為抑制劑。
　　結果：
　　Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+和Ni2+可以激活PPM1A和PPM1G，其激活能力:Fe2+＞

11、Mn2+＞Mg2+＞Co2+＞Ni2+;Cd2+、Zn2+、Hg2+、Ca2+、Sr2+、Cr2+、Ba2+和Li+可以抑制PPM1A和PPM1G的活性，其抑制能力:Cd2+＞Zn2+＞Hg2+＞Ca2+＞Sr2+＞(Cr2+，Ba2+)＞Li+。Cd2+是PP2C家族特異而有效地抑制劑。
　　第二部分：鎘通過作用于PP2C的M1金屬離子結合位點抑制PP2C的活性
　　研究目的：
　　研究Cd2+對PP2C抑制作用的分

12、子機制。
　　研究方法：
　　1.質粒構建與蛋白純化
　　將PPM1A、PPM1G野生型序列亞克隆到pet30a原核表達載體和pcDNA3.1真核表達載體上，并以該表達質粒為模板構建一系列的突變。pet30a-PPM1A、pet30a-PPM1G及其突變的表達和純化通過Ni-NTA親和層析進行蛋白純化。
　　2.野生型PPM1A、PPM1G及不同突變體的酶動力學研究
　　1)對小分子底物pNPP的磷酸酶活力

13、:pNPP作為底物，Mn2+作為激活劑，Cd2+作為抑制劑。
　　2)對體外純化pERK2蛋白的磷酸酶活力:磷酸化pERK2蛋白作為底物，Mn2+作為激活劑，Cd2+作為抑制劑。
　　3.細胞功能檢測
　　1)細胞內MAPK信號通路及Akt信號通路
　　人胚胎腎293細胞(HumanEmbryonicKidney293cell，HEK293)轉染野生型PPM1A、PPM1G及其突變后，加入Cd2+孵育，檢測Cd2

14、+抑制PPM1A、PPM1G或其突變后，pERK1/2、pP38、pJNK及pAKT的磷酸化水平。
　　2)細胞周期
　　HEK293細胞轉染野生型PPM1A后，加入Cd2+孵育，檢測Cd2+抑制PPM1A后，細胞周期的變化。
　　結果：
　　1.Cd2+通過M1金屬離子結合位點抑制PPM1A和PPM1G的磷酸酶活性。
　　PPM1A的第60位的天冬氨酸(D60)、第239位的天冬氨酸(D239)和第282

15、位的天冬氨酸(D282)共同組成了PPM1A的M1金屬離子結合位點。同理，PPM1G的D60、第441位的天冬氨酸(D441)和第496位的天冬氨酸(D496)共同組成了PPM1G的M1金屬離子結合位點。D60A和D60N這2個突變體降低了Mn2+與酶的結合能力，同時也降低了Cd2+的抑制作用。除此之外，PPM1A的D239和D282突變及PPM1G的D441和D496突變也大大降低了Cd2+的抑制效能。相反，組成M2金屬離子結合位點的

16、氨基酸突變后，對Cd2+的抑制作用沒有太大影響。
　　2.Cd2+無法抑制M1金屬離子結合位點的相關突變體對蛋白底物去磷酸化作用。
　　1.5μM的Cd2+即可充分阻斷野生型PPM1A和PPM1G催化的pERK蛋白的去磷酸化作用。但是1.5μMCd2+卻無法阻斷D282A和D239K對pERK蛋白的去磷酸化作用。
　　3.在細胞內低濃度的Cd2+可以抑制PPM1A和PPM1G調節(jié)的信號通路。
　　HEK293細胞

17、過表達PPM1A或D239K突變后，pERK、p38和pJNK的磷酸化水平明顯減少，但是加入1.5μMCd2+孵育6小時后，PPM1A無法發(fā)揮對pERK、p38及pJNK的去磷酸化作用，導致磷酸化水平增加;而相同濃度的Cd2+卻無法抑制D239K突變對pERK、p38及pJNK的去磷酸化作用。
　　4.Cd2+可以反轉PPM1A對細胞周期的阻滯作用。
　　HEK293細胞過表達PPM1A后，導致細胞分裂停滯在G2/M期，但是

18、加入1.5μMCd2+孵育24小時后阻斷了這一停滯。
　　第三部分：鎘對人臍靜脈內皮細胞的影響
　　研究目的：
　　探討Cd2+對人臍靜脈內皮細胞的影響。
　　研究方法：
　　1.細胞培養(yǎng)及Cd2+處理
　　人類臍靜脈內皮細胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)培養(yǎng)于含有0.1mg/ml肝磷酯、0.03-0.05mg/ml內皮細胞生長添加劑(endot

19、helialcellgrowthsupplement,ECGS)和10％胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)的F-12K培養(yǎng)基中。用不同濃度的Cd2+處理不同的時間后進行后續(xù)實驗。
　　2.MTT法檢測Cd2+對細胞增殖的影響，Tunel法檢測Cd2+對細胞凋亡的影響
　　(1)分別檢測不同濃度的Cd2+孵育細胞24個小時后，及10μM的Cd2+孵育細胞不同時間后，細胞增殖及細胞凋亡的變化。
　　(2)

20、過表達PPM1A野生型質粒后，用1μM的Cd2+孵育細胞24個小時，檢測細胞增殖及細胞凋亡的變化。
　　(3)將細胞內源性PPM1A干擾后，用1μM的Cd2+孵育細胞24個小時，檢測細胞增殖的變化。
　　3.檢測Cd2+對細胞內GSH和SOD活性影響
　　用不同濃度的Cd2+處理細胞24個小時，檢測細胞內GSH和SOD活性的變化。
　　結果：
　　Cd2+對HUVECs增殖及凋亡的影響具有濃度依賴性和時間依

21、賴性。低濃度的Cd2+會促進細胞增殖，而高濃度的Cd2+會促進細胞凋亡。另外，低濃度的Cd2+可以抑制PPM1A導致的細胞凋亡，高濃度的Cd2+可以通過增加氧化應激引起細胞凋亡。
　　結論：
　　1.Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+和Ni2+可以激活PPM1A和PPM1G;Cd2+、Zn2+、Hg2+、Ca2+、Sr2+、Cr2+、Ba2+可以抑制PPM1A和PPM1G。
　　2.鎘是PP2C有效的抑制劑，這一抑