鳶尾蛋白磷酸酶2C(PP2C)基因的克隆和功能分析及擬南芥PP2C基因家族的鑒定和基因組學分析.pdf

1、蛋白磷酸酶和蛋白激酶分別參與蛋白質的磷酸化和去磷酸化過程，在植物信號轉導過程中起重要的調節(jié)作用。蛋白磷酸酯酶2C(PP2C)是蛋白磷酸酶中的一大類，與植物的生長發(fā)育、細胞周期調節(jié)、信號轉導及環(huán)境脅迫應答等各種生物學過程相關。迄今為止，對植物PP2C的研究只是局限于個別基因的鑒定與功能分析，沒有從基因組水平對此基因家族進行大規(guī)模的鑒定和基因組學分析。 擬南芥基因組測序的完成為全面分析其基因家族提供了條件。實驗中利用已知的PP2C基

2、因序列作為檢索條件，通過BLAST查找其同源基因，從模式植物擬南芥基因組中獲得了編碼PP2C蛋白的基因序列。對上面的結果經(jīng)過數(shù)據(jù)處理之后，再用SMART和Pfam檢測序列中的PP2C元件，最后從擬南芥基因組中鑒定到了80個PP2C基因。在此基礎之上，我們又對擬南芥PP2C家族做了大規(guī)模的基因組學分析。 同時，我們從鳶尾(Iris tectorum)中克隆到了一個PP2C基因，命名為IrisPP2C1(Iris tectorum

3、Protein Phosphatase 2C1)。實驗中采用在洋蔥表皮細胞中瞬時表達的方法對IrisPP2C1蛋白的亞細胞定位進行了研究；然后又通過在擬南芥中過表達IrisPP2C1的方法對該基因的功能進行了初步研究。主要研究結果如下： 1)依據(jù)植物蛋白磷酸酶2C(Protein Phosphatase 2C，PP2C)基因的保守區(qū)設計簡并引物，運用RT-PCR方法，從鳶尾花中分離出一個長度為1198bp的PP2C基因的cDNA

4、克隆，編碼393個氨基酸，并命名為IrisPP2C1，Genbank注冊號為：EU366253。序列比對分析發(fā)現(xiàn)IrisPP2C1具備PP2C基因的保守結構域。 2)Southern雜交分析顯示，IrisPP2C1基因在鳶尾基因組中以低拷貝形式存在，并存在一個小的PP2C基因家族。Northern雜交分析表明，該基因的表達受植物激素ABA(Abscisic Acid)的誘導。 3)IrisPP2C1與GFP融合蛋白基因

5、在CaMV 35S啟動子的驅動下轉入洋蔥表皮細胞，在洋蔥表皮細胞的細胞核上檢測到綠色熒光，表明IrisPP2C1蛋白定位于細胞核上。這一結果與跨膜結構分析和核定位分析結果相一致。 4)構建表達載體pBI121-IrisPP2C1，利用農桿菌浸染法將35S::IrisPP2C1轉入擬南芥。利用PCR的方法，對轉基因植株進行了鑒定。轉基因呈現(xiàn)植株矮小，葉片變小、形狀變圓、顏色變深綠等表型。 5)在含有植物激素ABA的培養(yǎng)基萌

6、發(fā)時，轉基因擬南芥種子的萌發(fā)率低于野生型擬南芥；在含有5μM和10μM ABA的培養(yǎng)基上，野生型和轉基因植株根的伸長受到了不同程度的抑制，但轉基因植株的受抑制程度遠大于野生型植株。結果表明，過量表達IrisPP2C1基因提高了轉基因擬南芥對ABA的敏感性，也就是說IrisPP2C1在ABA信號調控過程中起到正調控作用。 6)利用BLAST同源檢索工具，從擬南芥全基因組序列中鑒定到了80個PP2C基因。 7)利用neigh

7、bor-joining法構建擬南芥中PP2C基因家族的系統(tǒng)發(fā)生樹，根據(jù)分支上的解靴帶值(bootstrap value)將擬南芥PP2C家族分為13個亞家族，基因結構和蛋白質元件分析結果都支持這一分類。進一步分析表明PP2C各個亞家族在雙子葉植物分化之前就已經(jīng)形成。 8)利用MEME元件分析工具獲得了PP2C基因家族中20個保守元件(motif)序列，這些元件中大部分廣泛分布于PP2C基因家族成員中，而個別元件僅僅存在于少數(shù)幾個