突變型人低氧誘導(dǎo)因子1α對(duì)大鼠后肢缺血模型的促血管新生作用.pdf

1、研究背景：
　　 冠心病是一種常見(jiàn)的心臟病，是我國(guó)城鄉(xiāng)居民的主要死亡原因，并將成為全世界首要的死亡原因和最大的疾病負(fù)擔(dān)。目前的治療手段主要有藥物治療和包括冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass graft，CABG)及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)在內(nèi)的血運(yùn)重建技術(shù)(revascularization)。終末期冠心病患者約占冠心病患者中

2、的10％，因冠狀動(dòng)脈病變彌漫，或病變血管細(xì)小等無(wú)條件進(jìn)行CABG及PTCA治療，藥物治療又不能滿意地控制其心絞痛癥狀，需要尋求一種新的更加適合于他們的治療方法。90年代以來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)，一些在機(jī)體生理和病理性的血管生成中起重要作用的生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)缺血組織的血管新生，加速側(cè)支循環(huán)的建立，有可能通過(guò)直接提高缺血區(qū)的血供來(lái)改善組織缺血，并設(shè)想導(dǎo)入外源性生長(zhǎng)因子以促進(jìn)血管新生，即所謂治療性血管生成(therapeutic angiogenesi

3、s)。這一方法為冠心病的治療提供了新思路。
　　 血管新生(neovascularization)包括vasculogenesis和angiogenesis兩種情況。Vascularogenesis主要是指由胚胎發(fā)育時(shí)的angioblast形成的原始血管網(wǎng)絡(luò)，繼而出現(xiàn)血管重塑(remodeling)，包括血管內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞、支持細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，形成完整的血管的過(guò)程。Angiogenesis是指從已存在的血管上，通過(guò)成

4、熟血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、游走，形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)的過(guò)程。血管新生的目的是側(cè)支血管形成并形成血流，以保障所有細(xì)胞的充足氧供。在成人缺血性心臟病和腫瘤的缺血缺氧組織中都會(huì)有血管數(shù)量的增多，低氧誘導(dǎo)的HIF-1α的激活是主要的分子機(jī)制。血管再生(Angiogenesis)、血運(yùn)重建是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，需要有許多血管生長(zhǎng)因子的參與，一些大樣本量、隨機(jī)、安慰劑對(duì)照試驗(yàn)的結(jié)果提示單一生長(zhǎng)因子的上調(diào)作用對(duì)于血管生成可能是不足的，成熟的血管形成需要大

5、量不同的細(xì)胞類(lèi)型的相互作用以及后繼的大量生長(zhǎng)因子及它們的受體的共同表達(dá)。所以，聯(lián)合基因治療成為新的研究熱點(diǎn)。
　　 人低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor1，HIF-1)被公認(rèn)是一個(gè)在應(yīng)答細(xì)胞氧張力變化的基因表達(dá)方面的重要調(diào)節(jié)因子，由兩個(gè)亞單位組成，氧調(diào)節(jié)亞單位HIF-1α和構(gòu)成性表達(dá)的亞單位HIF-1β。HIF-1α可調(diào)控下游60多種與血管生長(zhǎng)、血管張力、糖代謝、紅細(xì)胞生成及干細(xì)胞誘導(dǎo)分化等相關(guān)的

6、基因。低氧刺激可誘導(dǎo)HIF-1α產(chǎn)生，而HIF-1α可通過(guò)促進(jìn)下游一系列靶基因(如VEGF、VEGFR1、VEGFR2、NOS、IGF-Ⅱ等)的轉(zhuǎn)錄，觸發(fā)機(jī)體血管新生的反應(yīng)，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立，有望誘導(dǎo)生理功能完整的血管新生。
　　 但由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，HIF-1α只有在低氧條件下才能發(fā)揮功能，其蛋白形式在常氧(21％O2)下5分鐘即發(fā)生降解。主要與氧依賴降解區(qū)(oxygen dependentdegradation domai

7、n，ODDD)564位的脯氨酸(Prolyl，Pro)和402位的脯氨酸(Prolyl，Pro)發(fā)生羥基化有關(guān)，在低氧的狀態(tài)下，脯氨酰羥化酶的活性受到抑制，Pro564和Pro402羥基化反應(yīng)受阻，導(dǎo)致HIF-1α降解途徑中斷，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α水平增加，與HIF-1β二聚化形成具有生理活性的HIF-1，通過(guò)與靶基因如VEGF的低氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)結(jié)合，進(jìn)而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。而HIF-

8、1α轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(transactivation domain，TAD)的活性則主要受C-TAD端803位天門(mén)冬氨酰(Asparageine，Asn)的羥化調(diào)節(jié)，在常氧下，Asn803可在HIF抑制因子(factor inhibiting HIF-1α，F(xiàn)IH)作用下發(fā)生羥基化，使得C-TAD與轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活因子CBP/p300的結(jié)合受抑制，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。以上發(fā)現(xiàn)闡明了HIF-1α兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)區(qū)的功能，為此，《Sincese》曾發(fā)表評(píng)

9、論稱(chēng)“這些發(fā)現(xiàn)將為缺血性心臟病、中風(fēng)等許多疾病啟開(kāi)一種新的治療的可能性”。我們先期分別對(duì)HIF-1α的關(guān)鍵位點(diǎn)Pro564、Pro402和Asn803單一或聯(lián)合定點(diǎn)突變?yōu)锳la564、Ala402和Ala803，獲得了人突變體HIF-1α基因。
　　 為提高外源性基因的轉(zhuǎn)染效率，必須借助于載體。腺病毒因可轉(zhuǎn)染靜止細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率高，對(duì)于非復(fù)制狀態(tài)的心肌細(xì)胞來(lái)說(shuō)較為適宜；且不整合進(jìn)染色體，避免了插入突變的危險(xiǎn)。雖維持時(shí)間較短，但這對(duì)于

10、只需短時(shí)間表達(dá)基因產(chǎn)物的心血管病基因治療來(lái)說(shuō)，更為適合。故我們將人突變體HIF-1α基因成功包裝了腺病毒，獲得了三種不同位點(diǎn)突變的重組腺病毒人突變體HIF-1α基因。
　　 目的：
　　 探討不同位點(diǎn)突變的重組腺病毒人突變體HIF-1α基因(Ad-HIF-1α-Ala564，簡(jiǎn)稱(chēng)Ad-H564；Ad-HIF-1α-Ala564-Ala402，簡(jiǎn)稱(chēng)Ad-H564/402；Ad-HIF-1α-Ala564-Ala803，簡(jiǎn)稱(chēng)

11、Ad-H564/803)在大鼠急性下肢缺血模型內(nèi)的表達(dá)及對(duì)血管新生的影響。
　　 方法：
　　 ①在NEK293A細(xì)胞中大量擴(kuò)增腺病毒、氯化銫濃度梯度離心，透析純化，以獲得高純度、高活性的重組腺病毒人突變體HIF-1α基因。應(yīng)用電子顯微鏡、PCR、測(cè)序等方法鑒定腺病毒基因信息，用分光光度計(jì)法測(cè)定病毒滴度。②構(gòu)建急性大鼠下肢缺血模型，隨機(jī)分為6組，分別以Ad-LacZ、Ad-H0、Ad-H564、Ad-H564/402、A

12、d-H564/803和生理鹽水(NS)轉(zhuǎn)染術(shù)側(cè)下肢骨骼肌，③于轉(zhuǎn)染后1、3、5、7天，RT-PCR測(cè)定骨骼肌中HIF-1αmRNA的表達(dá)量；④于轉(zhuǎn)染后第28天，用免疫組化的方法檢測(cè)骨骼肌中HIF-1α的蛋白表達(dá)及CD31蛋白表達(dá)；⑤基因轉(zhuǎn)染后28天，選擇性下肢動(dòng)脈造影及動(dòng)脈鑄型觀察血管密度。
　　 結(jié)果：
　　 ①經(jīng)過(guò)在HEK293A細(xì)胞中大量擴(kuò)增、氯化銫密度梯度離心、透析純化后，各種重組腺病毒人突變體HIF-1α基因純

13、度提高，滴度達(dá)到1011OPU/ml，所攜帶的目的基因信息無(wú)丟失或變異，體外實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染效率高，未發(fā)現(xiàn)野生型腺病毒產(chǎn)生。②三種重組腺病毒人突變體HIF-1α基因轉(zhuǎn)染大鼠急性下肢缺血模型后，均可促進(jìn)骨骼肌內(nèi)HIF-1αmRNA的表達(dá)，且以第7天的表達(dá)量最高(F=24.942，P=0.000)；各突變體HIF-1α基因組的表達(dá)量均高于野生型HIF-1α基因組(F=99.380，P=0.000)；三種突變體基因組間相比，表達(dá)量最高的是Ad-H

14、IF-1α564/402組(0.7952±0.1563，P=0.000)，其次為Ad-HIF-1α564/803組(0.5815±0.0994，P=0.000)，再次為Ad-HIF-1α564組(0.5447±0.1413)。③三種重組腺病毒人突變體HIF-1α基因轉(zhuǎn)染大鼠急性下肢缺血模型后第28天，各突變體HIF-1α基因組大鼠的骨骼肌組織間及間質(zhì)組織中均可見(jiàn)明顯的HIF-1α蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞和CD31蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，且在血管周?chē)?/p>

15、較密集，微小血管著色更深，與野生型HIF-1α基因組及對(duì)照組的差異顯著。；各突變體HIF-1α基因相比，以Ad-H564/803組的最為密集。④三種重組腺病毒人突變體HIF-1α基因轉(zhuǎn)染大鼠急性下肢缺血模型后第28天，血管造影及動(dòng)脈鑄型顯示均可觸發(fā)機(jī)體血管新生，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立。雖側(cè)支血管不及野生型HIF-1α基因組的粗大，但末梢可見(jiàn)更多的絨毛樣微細(xì)血管；各突變體基因組間相比，以Ad-HIF-1α564/803組的促血管新生作用最強(qiáng)，

16、其次為Ad-HIF-1α564/402組，再次為Ad-HIF-1α564組。
　　 結(jié)論：
　　 ①外源性重組腺病毒人突變體基因Ad-H564、Ad-H564/402、Ad-H564/803均可促進(jìn)骨骼肌組織中的HIF-1αmRNA的表達(dá)和HIF-1α蛋白的表達(dá)，且較野生型HIF-1α基因的作用更強(qiáng)。②外源性重組腺病毒人突變體基因Ad-H564、Ad-H564/402、Ad-H564/803轉(zhuǎn)染大鼠急性下肢缺血模型后第2