外源表達Nkx2-5基因誘導(dǎo)P19細(xì)胞心肌分化.pdf

1、目的：哺乳動物成熟個體中的心肌細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，受到損傷時一般由瘢痕進行替代修復(fù)，由此造成的心肌細(xì)胞缺失和數(shù)量下降是導(dǎo)致心臟收縮功能下降，進而引起心力衰竭等心臟疾病的重要原因。近年來的研究表明，成體心臟中的心肌干細(xì)胞數(shù)量極少，不能對受損的心肌起到修復(fù)作用，加上心臟移植療法的供體、免疫原性和費用的限制，現(xiàn)在眾多研究者把目光投向細(xì)胞移植治療取代壞死的心肌細(xì)胞、增加有功能的心肌細(xì)胞數(shù)量。動物實驗也證實移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、新生心肌細(xì)胞甚

2、至骨骼肌細(xì)胞都可以在一定程度上改善心功能，但是細(xì)胞移植的研究還有很多亟待解決的難題，首要難題之一就是上述用于移植的細(xì)胞向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率太低，得不到移植所需的大量有收縮功能的心肌細(xì)胞。因此探索在心肌分化過程中的具體機制將具有重要意義，許多研究者推測心肌分化的過程始于某個或某些關(guān)鍵基因的啟動，通常這些基因的蛋白產(chǎn)物都是轉(zhuǎn)錄因子，它們可以使下游的靶基因呈級聯(lián)式地激活，直至分化完成。 同源盒基因Nkx2-5又稱為心臟特異性同源盒基因

3、(cardiac specific homeobox，Csx)，是所有脊椎動物心臟發(fā)生中最早表達的轉(zhuǎn)錄因子之一，也是目前研究最多的與心臟發(fā)育和心肌分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子之一，與早期研究發(fā)現(xiàn)的、決定果蠅心臟發(fā)育的tinman基因為同源基因，Nkx2-5屬于NK2型同源盒基因家族成員。該基因在復(fù)雜的心臟發(fā)育程序中起重要調(diào)控作用，許多研究表明Nkx2-5的表達對于胚胎心肌細(xì)胞的形成極為重要。在非洲蟾蜍胚胎，過表達Nkx2-5可以導(dǎo)致由心肌數(shù)目

4、增多引起的心臟增大。注射Nkx2-5到斑馬魚的胚胎導(dǎo)致心肌數(shù)目增多，心臟增大，將表達Nkx2-5的細(xì)胞移植至生心區(qū)以外的組織可引發(fā)心臟標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄和表達。國外也有報道Nkx2-5的表達可促進P19細(xì)胞和P19CL6細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，提高心特異基因的表達，且保護心肌免受脅迫引起的損害。研究證實，Nkx2-5基因調(diào)控心納素、心臟a-actin，心錨蛋白重復(fù)序列蛋白、A1腺甙受體、鈣網(wǎng)織蛋白、間隙連接蛋白40等基因的表達。這些目的基因編碼重

5、要的結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控心肌特性，說明Nkx2-5有轉(zhuǎn)錄調(diào)控心肌程序的功能。但Nkx2-5的表達能否使哺乳類干細(xì)胞產(chǎn)生有收縮功能的心肌細(xì)胞以及使非心肌細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞仍有不同爭議。而且國內(nèi)關(guān)于Nkx2-5在心肌分化中作用的相關(guān)報道少而又少，因此本研究擬做該方面的研究。 P19胚胎癌細(xì)胞(embryonal carcinoma cells，EC)是從C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中誘導(dǎo)形成的EC細(xì)胞系，體外培養(yǎng)經(jīng)多次傳代仍保持胚胎干細(xì)胞的特性。

6、P19細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可分化為包括心肌在內(nèi)的多種細(xì)胞，在P19細(xì)胞向心肌分化的過程中，其細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達及電生理特性與正常小鼠心肌發(fā)育過程相似，且該細(xì)胞易于進行基因操作，是研究心肌細(xì)胞發(fā)育的良好體外模型。 因此，本課題擬將Nkx2-5基因轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞，并篩選出穩(wěn)定表達Nkx2-5的P19細(xì)胞，觀察其在沒有誘導(dǎo)劑的情況下向心肌分化的情況。并研究在5-氮胞苷(5-azacytidine，5-aza)的作用下，穩(wěn)定表達Nkx2-5的

7、P19細(xì)胞在單層培養(yǎng)時向心肌分化的情況，以闡明心肌細(xì)胞分化過程中的一些規(guī)律，為各種干細(xì)胞有效轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞提供策略。 方法： 1.pEGFP-N1-Nkx2-5真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定 由日本Hiroshi Akazawa博士惠贈的pEFSA-HA-Nkx2-5質(zhì)粒，經(jīng)常規(guī)CaCl2法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，擴增提取之后經(jīng)XbaI，HindIII雙酶切鑒定。以pEFSA-HA-Nkx質(zhì)粒為模板，PCR擴

8、增Nkx2-5基因全長，瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收靶片斷。再以擴增的Nkx2-5基因全長為模板，PCR擴增Nkx2-5基因編碼框，瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收靶片斷。PCR擴增的Nkx2-5基因編碼框和載體pEGFP-N1分別經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切過夜，分別回收后將二者連接，置16℃恒溫過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)16～24h；挑取單個陽性菌落，提取重組質(zhì)粒，進行菌落

9、PCR鑒定有無目的片段，再經(jīng)BamHI、XhoI雙酶切鑒定，同時將構(gòu)建質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)公司測序。 2.外源表達Nkx2-5誘導(dǎo)聚集P19細(xì)胞向心肌分化 實驗分轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染之前通過預(yù)實驗確定合適的細(xì)胞接種密度，轉(zhuǎn)染最佳體系，G418篩選濃度。本實驗采用陽離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將質(zhì)粒pEGFP-N1-Nkx2-5轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞，轉(zhuǎn)染之后24h將細(xì)胞1:10比例傳代，G418穩(wěn)

10、定篩選兩周后，將篩出細(xì)胞聚集培養(yǎng)四天形成聚集體，聚集體移入培養(yǎng)皿中貼壁生長。在貼壁的4天、8天、12天、16天取細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測desmin、a-sarcomeric actin和cTnT的表達；免疫熒光雙標(biāo)檢測a-sarcomeric actin和cTnT的共表達；RT-PCR檢測GATA-4、a-MHC、ANP基因的表達；Westem blot檢測a-sarcomericactin和cTnT蛋白的表達。并取貼壁16天的細(xì)胞透射

11、電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)的變化。未轉(zhuǎn)染組將P19細(xì)胞直接聚集培養(yǎng)，觀察分化的情況，未轉(zhuǎn)染組檢測指標(biāo)和取材時間同轉(zhuǎn)染組。 3.5-氮胞苷誘導(dǎo)外源表達Nkx2-5的P19細(xì)胞單層培養(yǎng)時向心肌分化 實驗分為實驗組和對照組，實驗組為5-aza誘導(dǎo)的穩(wěn)定表達Nkx2-5基因的單層培養(yǎng)P19細(xì)胞，對照組為5-aza誘導(dǎo)的單層培養(yǎng)P19細(xì)胞。用1μmol/L的5-aza濃度分別對實驗組和對照組的細(xì)胞進行誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)的4天、8天、12天、16天

12、取細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測a-sarcomeric actin和cTnT的表達；免疫熒光雙標(biāo)檢測a-sarcomeric actin和cTnT的共表達；RT-PCR檢測GATA-4、a-MHC和ANP基因的表達；Western blot檢測a-sarcomeric actin和cTnT的蛋白表達；并取實驗組誘導(dǎo)16天的細(xì)胞透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)論： 1.成功擴增出人Nkx2-5基因編碼框；成功構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pEG

13、FP-N1-Nkx2-5，為以后研究Nkx2-5基因在心肌分化和心臟發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。 2.真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1-NKx2-5可在P19細(xì)胞中表達，可以用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選。 3.外源表達Nkx2-5基因的P19細(xì)胞不需誘導(dǎo)劑，只聚集培養(yǎng)即可向心肌細(xì)胞分化，誘導(dǎo)心肌標(biāo)志物和橫紋肌標(biāo)志物的表達，且表達量隨培養(yǎng)天數(shù)增加而逐漸增高。外源表達NKx2-5基因可誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌分化。 4 5-az

14、a誘導(dǎo)使單層培養(yǎng)的P19細(xì)胞向心肌分化，表達心肌早期轉(zhuǎn)錄因子和心肌特異基因，但是沒有蛋白產(chǎn)物的表達。 5 5-aza誘導(dǎo)使單層培養(yǎng)的外源表達Nkx2-5基因的P19細(xì)胞向心肌分化，在基因水平和蛋白水平表達心肌標(biāo)志物和橫紋肌標(biāo)志物，且表達量隨培養(yǎng)天數(shù)增加而逐漸增高。 6 在5-aza誘導(dǎo)單層培養(yǎng)時，外源表達NKx2-5基因的P19細(xì)胞向心肌分化的情況優(yōu)于未轉(zhuǎn)染的P19細(xì)胞。說明Nkx2-5基因可以促進P19細(xì)胞單層培養(yǎng)時向