Pegfp-N2-BMP2轉染P19細胞誘導向心肌分化.pdf

1、目的：心肌梗死是一種嚴重危害人類健康的疾病，心肌梗死后功能性心肌細胞丟失和疤痕組織形成使存活的心肌細胞減少、繼發(fā)心室重構，是造成心肌梗死患者發(fā)生心力衰竭甚至死亡的重要原因。人體內心肌細胞不能再生，損傷的心肌細胞不能修復和分化，故臨床藥物治療、介入治療不能逆轉已壞死的心肌，無法促使梗死的心肌再生，使心肌梗死患者的遠期預后不能得到顯著改善。而心臟移植由于手術復雜、供體來源困難和費用高等原因，在臨床很難推廣。治療心肌梗死的關鍵是增加梗塞區(qū)內功

2、能性心肌細胞的數量，目前，細胞移植治療正成為一種新的治療方法。因此，尋找可代替死亡細胞的合適的種子細胞來防治心肌梗死后的心衰、心室重構，改善心功能，是近年來研究的主要問題。
　　 骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族至少包括40個成員，至今已鑒定了的BMP有15種之多，都屬于轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族，以功能域的同源性為基

3、礎，它又分成幾個BMP超家族，即BMP-2、4超家族，BMP-5、6、7、8超家族，生長分化因子-5(growth and differentiationfactor,GDF-5)、GDF-6(BMP-13)、GDF-7(BMP-12)超家族，以及BMP-3與GDF-10(BMP-3b)超家族。其中，BMP-2、4超家族具有很高的生物活性，有研究表明BMP-2、4參與調控心臟發(fā)生和心肌分化過程。對雞胚的研究證實，在早期雞胚的心臟發(fā)育部位

4、，能夠檢測到BMP2的表達。另有研究表明外源加入BMP2蛋白可誘導骨髓間充質細胞分化為心肌樣細胞，且有資料表明BMP信號途徑是心臟早期轉錄因子GATA-4、NKx2.5上游效應分子。此類研究表明，BMP2在胚胎時期的心臟發(fā)育、心肌分化中起著非常重要的作用，但是BMP2在心肌分化中的作用機制，尤其是與心肌細胞轉錄因子如NKx2.5、GATA-4等之間的相互作用國內外未見報道，另外，外源表達BMP2基因能否高效誘導P19細胞心肌分化亦未見報

5、道。因此本實驗選用BMP2基因轉染P19細胞，觀察其誘導心肌分化的作用。
　　 P19胚胎瘤細胞(P19 embryonal carcinoma cells，P19ECCs)是從C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中分離得到，可以在體外迅速大量擴增，多次傳代也不喪失其分化能力。P19細胞是多潛能細胞，可分化為內胚層、中胚層、外胚層3個胚層的不同類型的細胞。在體外不同的誘導條件下可被誘導為包括心肌細胞、骨骼肌細胞及神經元在內的多種類型的細胞

6、，因而是一種較為理想的用于研究細胞分化和發(fā)育的工具細胞，如果在體外誘導向心肌分化后進行移植，可能成為較理想的替代壞死心肌的種子細胞。因此，P19細胞常作為研究心臟發(fā)育和心肌分化的一個良好體外模型。但在P19細胞向心肌細胞分化的過程中細胞聚集體的形成和誘導劑的結合是兩個必需條件，目前尚沒有明確的資料證明P19細胞在單層培養(yǎng)的情況下可以向心肌細胞分化。因此，缺少這兩個條件之一，P19細胞不能向心肌細胞分化。
　　 本課題擬將BMP2

7、基因轉染P19細胞，聚集培養(yǎng)后，觀察其在沒有誘導劑的情況下向心肌分化的情況。并研究在二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide DMSO)的作用下，穩(wěn)定表達BMP2的P19細胞在單層培養(yǎng)時向心肌分化的情況，為P19細胞有效轉化為心肌細胞探索一個比較好的誘導方式，為心肌梗死的細胞移植治療探索一個合適的種子細胞。
　　 方法：
　　 1.pEGFP-N2-BMP2真核表達質粒的構建與鑒定
　　 以pEFSA-B

8、MP2質粒為模板，PCR擴增出BMP2的序列，上游引物：5’-GCCAGATCTAAAGGTCGACCATGGT-3′，引入酶切位點BglⅡ；下游引物：5′-TTAGAATTCGCGACACCCACAACC-3′，引入酶切位點EcoRⅠ。反應完畢后，經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化靶片斷。將條帶單一的PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分離，小劑量膠回收試劑盒回收，并用限制性內切酶BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切純化BMP2 DNA。限制性內切

9、酶BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切pEGFP-N2載體并純化。將PCR擴增的BMP2 DNA與雙酶切后的pEGFP-N2經T4 DNA連接酶進行連接反應，連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于固體LB培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)16-24h；挑取單個陽性菌落，提取重組質粒，進行菌落PCR鑒定有無目的片段，再經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定、測序鑒定。
　　 2.pEGFP-N2-BMP2轉染P19細胞后聚集培養(yǎng)誘導向心肌分化<

10、br>　　 實驗分實驗組和對照組。實驗組為轉染pEGFP-N2-BMP2的P19細胞，轉染之前通過預實驗確定合適的細胞接種密度，轉染最佳體系，G418篩選濃度。本實驗采用陽離子轉染試劑Lipofectamine2000將質粒pEGFP-N2-BMP2轉染P19細胞，轉染之后24h將細胞按1×105/ml密度傳代，G418穩(wěn)定篩選14天后，將篩出細胞聚集培養(yǎng)4天形成聚集體，聚集體移入培養(yǎng)皿中貼壁生長。在貼壁的4天、8天、12天、16天取

11、細胞，免疫細胞化學檢測心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和心肌肌動蛋白α(α-cardiac actin)的表達；RT-PCR檢測GATA-4、NKx2.5兩個基因的表達；Western blot檢測α-cardiac actin和cTnT蛋白的表達。并取貼壁16天的細胞透射電鏡觀察細胞超微結構的變化。對照組將P19細胞直接聚集培養(yǎng)，觀察細胞分化的情況，對照組取材時間和檢測指標同實驗組。
　　 3.

12、DMSO誘導轉染pEGFP-N2-BMP2的P19細胞單層培養(yǎng)時向心肌分化
　　 實驗分為實驗組和對照組，實驗組為轉染pEGFP-N2-BMP2質粒的P19細胞，DMSO誘導單層細胞培養(yǎng)，對照組為未轉染質粒的P19細胞，DMSO誘導單層細胞培養(yǎng)。兩組均在誘導的4天、8天、12天、16天取細胞，免疫細胞化學檢測α-cardiac actin和cTnT的表達；RT-PCR檢測GATA-4、NKx2.5兩個基因的表達；Western

13、blot檢測α-cardiac actin和cTnT蛋白的表達。并取貼壁16天的細胞做透射電鏡觀察細胞超微結構的變化。
　　 結果：
　　 1.pEGFP-N2-BMP2真核表達質粒的構建與鑒定
　　 以pEFSA-BMP2質粒為模板，PCR擴增出約1.2kb的基因片段，與BMP2基因編碼框(1191bp)大小一致。經BglⅡ和EcoRⅠ雙酶切分別得到帶有BglⅡ和EcoRⅠ酶切位點的約1.2kb的BMP2基因片

14、段和4.7kb的pEGFP-N2載體，然后回收、連接轉化后，篩出新生菌落。進行PCR反應，結果顯示從重組質粒中可擴增出大小約1.2kb的基因片段。所提質粒經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切之后，可獲得約1.2kb和4.7kb的條帶，分別與BMP2基因(1191bp)和載體pEGFP-N2(4.7kb)的大小一致。用啟動子CMV引物進行測序，測序結果校對后經BLAST分析，表明此核酸序列與GeneBank中BMP2 mRNA序列(NM-001

15、200)的編碼序列完全吻合，酶切位點完整，說明已將BMP2基因編碼框正確插入pEGFP-N2載體的多克隆位點(MCS)。確定在本實驗中，pEGFP-N2-BMP2重組質粒構建成功。
　　 2.pEGFP-N2-BMP2轉染P19細胞后聚集培養(yǎng)誘導向心肌分化
　　 通過反復實驗確定：細胞傳代密度：2×105/ml，轉染比率1:2.5，G418穩(wěn)定篩選濃度：600μg/ml。實驗組在轉染質粒pEGFP-N2-BMP2之后的1

16、8-24h可見部分細胞表達EGFP-BMP2融合蛋白，G418篩選2周后，大多數細胞可觀察到綠色熒光，這些細胞為穩(wěn)定表達BMP2的P19細胞。實驗組和對照組的細胞在軟瓊脂糖培養(yǎng)基內懸浮培養(yǎng)4天形成聚集體，將聚集體接種到培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，細胞由周邊爬出，細胞胞體變大變長，伸出突起相連在一起。免疫細胞化學結果：實驗組細胞貼壁培養(yǎng)4天時，α-cardiac actin和cTnT都不表達，第8天的時候，兩種蛋白均有表達，但是表達量較少，12天和

17、16天的表達量逐漸增多，陽性反應產物分布在細胞質中，呈現棕黃色，隨著時間的延長，細胞中出現明顯棕黃色束狀結構。陽性細胞吸光度值統(tǒng)計結果顯示：兩種蛋白表達量8天、12天、16天與對照組比有顯著差異(P＜0.01），其他天數間比較也有顯著差異(P＜0.01)。對照組沒有檢測到兩種蛋白的陽性表達。RT-PCR結果：實驗組GATA-4和Nkx2-5在貼壁培養(yǎng)的4天開始有表達，但表達量較弱，8天、12天和16天表達逐漸增多，統(tǒng)計結果顯示：GATA

18、-4和NKx2.5的表達4天、8天、12天、16天與對照組比有顯著差異(P＜0.01)，其他天數間比較也有顯著差異（P＜0.01）。對照組沒有檢測到兩種基因的陽性表達。Western Blot結果：實驗組細胞，α-cardiac actin和cTnT兩種蛋白在4天沒都有表達，在8天的時候有表達，12天和16天時表達量逐漸增高。統(tǒng)計結果顯示：兩種蛋白的表達8天、12天、16天與對照組比有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，其他天數間比較也有統(tǒng)計學

19、差異(P＜0.01）。對照組細胞兩種蛋白均沒有表達。透射電鏡觀察發(fā)現，實驗組的細胞經聚集、貼壁培養(yǎng)16天后，細胞胞質中可見較多的高爾基復合體、游離核糖體、粗面內質網、線粒體等細胞器，在一些細胞的胞質中，可見平行排列的肌絲樣結構；相鄰細胞分化出細胞連接，細胞連接的胞質內出現肌絲樣結構，未發(fā)現肌節(jié)樣結構。對照組未發(fā)現分化的細胞。
　　 3.DMSO誘導轉染pEGFP-N2-BMP2的P19細胞單層培養(yǎng)時向心肌分化
　　 在D

20、MSO誘導時，隨著誘導時間延長，實驗組和對照組細胞均有聚集生長的趨勢，生長緩慢。兩組細胞在培養(yǎng)過程中都沒有發(fā)現細胞跳動現象。免疫細胞化學結果：實驗組細胞α-cardiac actin和cTnT在4天的時候都沒有表達，在8天、12天、16天時均有表達，并隨時間延長而逐漸增高，細胞中棕黃色成束絲樣結構增多。陽性細胞吸光度值統(tǒng)計結果顯示：兩種蛋白在8天、12天、16天的表達量與對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，其他天數間比較也有顯著差異(

21、P＜0.01)。對照組細胞在DMSO誘導的4天、8天、12天、16天均沒有檢測到α-cardiac actin和cTnT的陽性表達。RT-PCR結果：實驗組，穩(wěn)定表達BMP2的P19細胞在DMSO誘導下、單層培養(yǎng)后，GATA-4和NKx2.5在第4天開始有表達，但表達量較弱，8天、12天、16天表達逐漸增多。統(tǒng)計結果表明：GATA-4的表達4天、8天、12天、16天與對照組比有顯著差異(P＜0.01)，其他天數間比較也有顯著差異(P＜0

22、.01或P＜0.05);NKx2.5的表達4天、8天、12天、16天與對照組比有顯著差異(P＜0.01)，其他天數間比較除12天與16天無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)外也均有顯著差異(P＜0.01)。在對照組，各時間點均未檢測到兩種基因的陽性表達。Western Blot結果：實驗組，穩(wěn)定表達BMP2的P19細胞在DMSO誘導下、單層培養(yǎng)后，α-cardiac actin和cTnT在4天都沒有表達，在8天的時候開始有表達，12天和16天時

23、表達逐漸增多。統(tǒng)計結果顯示：α-cardiac actin在4天、8天、12天、16天與對照組比有統(tǒng)計學差異(P＜0.01或P＜0.05)，其他天數間比較也有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。cTnT在8天的時候有表達，但與對照組比沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，其他天數間比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。對照組細胞兩種蛋白均沒有表達。透射電鏡觀察發(fā)現，實驗組細胞胞質中可見較多的高爾基復合體、游離核糖體、粗面內質網、線粒體等細胞器，在一些細胞

24、的胞質中，可見平行排列的肌絲樣結構；相鄰細胞分化出細胞連接，細胞連接的胞質內出現微絲樣結構，未發(fā)現肌節(jié)樣結構。對照組未發(fā)現分化的細胞。
　　 結論：
　　 1.本實驗成功構建了pEGFP-N2-BMP2真核表達質粒，為以后研究BMP2基因的作用奠定了基礎。
　　 2.本實驗將pEGFP-N2-BMP2真核表達質粒轉染P19細胞，可見其在P19細胞中表達，因此，pEGFP-N2-BMP2真核表達質?？梢杂糜谡婧思毎?/p>

25、的轉染和穩(wěn)定篩選。
　　 3.轉染了質粒pEGFP-N2-BMP2的P19細胞不需要誘導劑的誘導，只聚集培養(yǎng)即可分化為心肌樣細胞，表達心臟早期轉錄因子、心肌特異基因和心肌特異蛋白，在基因和蛋白水平表達心肌源性細胞的特異性標志物。結果表明外源表達BMP2基因可以誘導P19細胞在沒有誘導劑誘導時即向心肌分化，為P19細胞有效轉化為心肌細胞探索了一個比較好的誘導方式。
　　 4.轉染了質粒pEGFP-N2-BMP2的P19細胞

26、不需要誘導劑的誘導，只聚集培養(yǎng)即可分化為心肌樣細胞，表明BMP2基因在P19細胞向心肌細胞分化過程中具有促心肌分化作用，說明BMP信號在P19細胞分化為心肌細胞過程中起著非常重要的作用。
　　 5.DMSO誘導使單層培養(yǎng)的穩(wěn)定表達BMP2基因的P19細胞向心肌分化，表達心臟早期轉錄因子、心肌特異基因和心肌特異蛋白，在基因和蛋白水平表達心肌源性細胞的特異性標志物，表明BMP2基因可以促進P19細胞單層培養(yǎng)時向心肌細胞分化，進一步說