RANTES在大鼠附睪基細胞中的作用研究.pdf

1、在過去的三十年,整個人類的生育能力在逐漸降低。不孕癥是現(xiàn)在世界上1/6的夫婦主要的健康問題。其中男性生殖功能紊亂占很大比例,目前大部分男性的病因仍不能被解釋。男性不育癥常見的病因包括精子運動能力低下和精卵結合力降低。精子在睪丸中完成形態(tài)分化,只有在通過附睪的過程中,精子經歷一系列復雜的變化后,才能獲能而達到功能上的成熟,并在附睪內儲存。附睪是由大量的曲細精管構成,在形態(tài)學和功能學上有明顯的區(qū)域劃分,包括起始部、頭部、體部、尾部。附睪上皮

2、有四種不同形態(tài)的細胞分布,而每一種細胞均參與形成并調節(jié)附睪管腔液體的酸性環(huán)境,以此維持精子的濃縮、成熟、儲存、趨化運動。精子在附睪中成熟和儲存過程需要一個低碳酸氫鹽和低pH的環(huán)境來維持精子靜息狀態(tài)。附睪上皮細胞作為一個整體,能夠協(xié)同作用,建立和維持附睪酸性微環(huán)境。亮細胞在頂膜上表達高水平的V-ATP酶,通過ATP供能把質子泵入附睪管腔中,亮細胞胞漿內的可溶性腺苷酸環(huán)化酶(sAC)是一種HCO3-依賴性的化學感受器,可以直接被HCO3-激

3、活,從而使cAMP濃度升高,導致V-ATP酶在頂膜上的聚集。主細胞能夠分泌HCO3-至附睪管腔。而來自于精子和主細胞的ATP被釋放入管腔,且有狹長突起的基細胞能夠特異性地表達ANGII的II型受體(AGTR2),這些受體受到ANGII的刺激后,能夠使V-ATP酶在附睪亮細胞的頂膜面微絨毛聚集。ANGII可以作用于附睪上皮基細胞腔膜面上的受體,激活了NO的產生,NO經過旁分泌進入亮細胞內,激活sGC,sGC繼而引發(fā)了cGMP介導的V-AT

4、P酶在亮細胞微絨毛的聚集。由此,附睪上皮主細胞和亮細胞、基細胞和亮細胞之間形成復雜的協(xié)同關系,共同維持管腔液的酸性環(huán)境。而關注和破譯這些胞內的對話能夠幫助我們定義男性生殖系統(tǒng)的發(fā)育機制。
　　受激活調節(jié)正常T細胞表達和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted,RANTES),最初被認為是一種典型的趨化性細胞因子。RANTES被報道具有多重

5、的生理學和病理學效應,例如在免疫學效應上,RANTES不但具有抑制HIV病毒復制的能力,而且在特定的環(huán)境下能增強復制,且對腫瘤有一定的誘導和促生長作用。RANTES通過4種趨化因子受體傳導信號,包括CCR1、CCR3、CCR4和CCR5,均屬于7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族成員。其中CCR1和CCR5屬于高親和力受體。
　　我們目前的研究認為RANTES特異性高表達在附睪組織,在精子成熟過程中具有非常重要的作用。之前我們已明確基細胞作

6、為附睪管腔環(huán)境的感受器能與亮細胞協(xié)同作用。具體來說,基細胞釋放NO調節(jié)鄰近亮細胞,調控其V-ATPase依賴的質子分泌,同時基細胞能夠特異性地表達ANGII的II型受體(AGTR2),這些受體受到附睪管腔內ANGII的刺激后,也能夠促使亮細胞泌酸。有文獻報道RANTES可以促進巨噬細胞釋放NO,而基細胞的超微結構與巨噬細胞極其相似,被認為是附睪管腔內固定的巨噬細胞。由此推測RANTES可能在ANGII的刺激下通過自分泌方式,激活基細胞釋

7、放NO,再經NO信號通路,在基細胞與亮細胞的串話調節(jié)中發(fā)揮作用,進而協(xié)助維持附睪管腔液體的酸性環(huán)境。
　　為了研究RANTES在附睪酸性微環(huán)境中的作用,本實驗首先檢測了RANTES在正常大鼠附睪內的表達,進而利用輸精管切除術構建附睪酸性微環(huán)境破壞的模型,對比觀察手術組和假手術組RANTES的變化,證明RANTES參與調節(jié)附睪管腔酸性微環(huán)境的作用,為深入探討該分子在精子成熟過程中的重要作用與具體機制提供新的依據。
　　本實驗分

8、為以下兩個部分:
　　第一部分:RANTES在大鼠附睪的表達與定位
　　通過PCR、Western blot和免疫組織化學法等技術檢測大鼠附睪RANTES及其受體CCR1、CCR5的表達,主要結果如下:
　　1、PCR結果顯示RANTESmRNA在大鼠附睪有表達。Western blot檢測到RANTES蛋白在大鼠附睪頭部、尾部有較高表達,在體部的表達量相對較低。免疫組織化學法檢測結果提示,RANTES在附睪管上皮的上

9、皮細胞有高表達。免疫熒光雙標實驗利用基細胞特異性細胞標記物COX1,進一步證實了RANTES定位在附睪上皮的基細胞。
　　2、PCR結果顯示RANTES受體CCR1和CCR5mRNA在附睪均有表達,Western blot檢測到CCR1、CCR5蛋白在大鼠附睪頭部、體部和尾部均有表達。免疫組織化學實驗表明受體CCR1、CCR5在附睪上皮表達于基細胞。免疫熒光雙標染色分別檢測RANTES與CCR1、CCR5的細胞共定位情況,顯示RA

10、NTES與CCR1、CCR5在附睪管的基細胞共存。
　　以上結果表明:RANTES與CCR1、CCR5共定位在附睪管的基細胞,推測RANTES可能通過自分泌方式在大鼠附睪基細胞功能活動方面起重要作用。
　　為了證實這個推測,我們進行第二部分的模型研究。
　　第二部分:附睪酸性環(huán)境被破壞后,RANTES及其受體的表達變化
　　建立大鼠輸精管切除術后附睪管腔酸性微環(huán)境被破壞的動物模型,采用放射免疫分析技術檢測附睪組織

11、勻漿液上清內ANGII水平的變化;Realtime PCR檢測ANGII受體AGTR2mRNA水平的變化,Western blot檢測AGTR2蛋白水平的變化后;進一步通過Realtime PCR、Western blot觀察RANTES及其受體在mRNA以及蛋白水平的表達變化,并用Realtime PCR、Western blot檢測iNOsmRNA水平和蛋白水平的變化。
　　主要結果如下:
　　1、檢測大鼠附睪管腔pH值

12、,pH值增高,說明模型建立成功,實驗可用。輸精管切除術后,附睪管腔酸性微環(huán)境被破壞,ANGII水平顯著下調,AGTR2mRNA和蛋白水平明顯降低;
　　2、實時定量PCR證明手術組與假手術組相比,RANTES在大鼠附睪頭部、體部和尾部的表達水平明顯降低。Western blot顯示,RANTES及其受體CCR1、CCR5在大鼠附睪頭部、體部和尾部的表達水平明顯下降。
　　3、iNOs在大鼠附睪頭部、體部和尾部的mRNA和蛋白

13、水平顯著降低。
　　這些結果顯示輸精管切除術后影響了附睪管腔酸性微環(huán)境的改變,RANTES及其受體的表達量降低,表明RANTES對維持附睪管腔酸性微環(huán)境具有積極的作用。該結果與我們第二部分的推測一致?？傊?我們的研究結果表明RANTES可能在ANGII的刺激下通過自分泌方式,激活基細胞釋放NO,再經NO信號通路,在基細胞與亮細胞的串話調節(jié)中發(fā)揮作用,從而協(xié)助維持附睪管腔液的酸性環(huán)境。維持精子處于靜息狀態(tài),其具體機制還有待我們在細胞