細(xì)胞齡相關(guān)分子在不同月齡大鼠睪丸和附睪的表達.pdf

1、第一部分c-kit、HIWI和波形蛋白在不同月齡大鼠睪丸和附睪的表達 目的：檢查c-Kit、HIWI和波形蛋白在不同月齡大鼠睪丸和附睪組織中的表達差異，研究睪丸和附睪在成熟和衰老過程中表達的規(guī)律性改變，為研究男性生殖系統(tǒng)衰老提供理論依據(jù)。 方法：運用免疫組織化學(xué)（S-P 法）檢查6月齡、12月齡和24月齡SD 大鼠睪丸和附睪組織中c-Kit、HIWI和波形蛋白抗血清免疫反應(yīng)強度，并對其進行比較分析。 結(jié)果：

2、c-Kit 特異性免疫反應(yīng)陽性主要表達于精原細(xì)胞，其他細(xì)胞表達水平甚弱。附睪上皮、附睪管腔內(nèi)成分亦有c-Kit 陽性表達。HIWI 在大鼠睪丸和附睪組織中表達也很豐富，6月齡和12月齡大鼠中各級生精細(xì)胞，特別是精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞為免疫反應(yīng)強陽性細(xì)胞；支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、類肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞亦為HIWI 陽性細(xì)胞。附睪上皮有HIWI 陽性表達。但是24月齡大鼠睪丸和附睪組織中隨年齡增長HIWI 表達下調(diào)（P>0.05）。波形蛋白在睪

3、丸和附睪組織中表達模式為6月齡大鼠睪丸和附睪組織中低表達，24月齡大鼠睪丸和附睪組織表達明顯上調(diào)（P>0.01）。 結(jié)論：c-kit、HIWI 在24月齡動物睪丸和附睪組織中表達下調(diào)，波形蛋白表達隨增齡而明顯增強。結(jié)果提示，睪丸和附睪組織的衰老與細(xì)胞和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常密切相關(guān). 第二部分Gas7 在不同月齡大鼠睪丸和附睪的表達 實驗一Gas7-GST 融合蛋白的表達和多克隆抗體的制備 目的：制備Gas7

4、 多克隆抗體，為深入研究Gas7 在睪丸和附睪的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供特異工具。 方法：PCR 擴增編碼大鼠Gas7 羧基末端456bp的DNA 片段，DNA 重組入原核表達質(zhì)粒pGEX-3X，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)產(chǎn)生GST-Gas7 融合蛋白。經(jīng)谷胱甘肽-瓊脂糖珠(GlutathioneSepharose 4B) 介質(zhì)填充的層析柱分離純化蛋白，免疫家兔制備多克隆抗體，West

5、ernBlot檢測抗體的免疫效果和抗體的特異性。 結(jié)果：成功構(gòu)建pGEX-3X-Gas7 原核表達載體，獲得分子量約為43kD的融合蛋白，免疫家兔后得到抗Gas7的多克隆抗體。通過Western Blot檢測顯示，抗體的效價在1：100 000 以上；在腦組織和睪丸組織的表達與國外報道一致，同時發(fā)現(xiàn)在附睪組織亦有表達。 結(jié)論：重組質(zhì)粒表達的Gas7-GST 融合蛋白具有良好的抗原性，成本效益良好。制備的特異性和高效價的抗

6、Gas7的多克隆抗體，能夠滿足針對Gas7 免疫印跡和免疫組化技術(shù)檢查等實驗要求。 實驗二Gas7蛋白及其mRNA 在不同月齡大鼠睪丸和附睪的表達 目的：檢查Gas7蛋白及其mRNA 在不同月齡大鼠睪丸和附睪組織中的表達差異，研究睪丸和附睪在成熟和衰老過程中規(guī)律性變化，旨在研究男性生殖系統(tǒng)衰老的病理機制。 方法：運用免疫組織化學(xué)方法（S-P 法）和組織原位雜交技術(shù)檢查6月齡、12月齡和24月齡SD 大鼠睪丸和附睪

7、組織中Gas7蛋白及其mRNA 表達情況，并對其進行比較分析。 結(jié)果：免疫組化S-P 法顯示，Gas7蛋白在6月齡和12月齡睪丸和附睪組織中呈低表達，主要表達于減數(shù)分裂后的圓形精子細(xì)胞、長形精子細(xì)胞的尾部、間質(zhì)細(xì)胞、類肌細(xì)胞、附睪管壁及精子尾部；在24月齡睪丸和附睪組織表達明顯上調(diào)。原位雜交方法顯示結(jié)果與免疫組化結(jié)果相似，Gas7mRNA 陽性棕黃色顆粒雜交信號在6月齡和12月齡睪丸和附睪組織中呈低表達，而在24月齡睪丸和附睪組