TLR4通過(guò)增強(qiáng)TGF-β-Smad信號(hào)通路介導(dǎo)前列腺增生上皮細(xì)胞EMT的機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景]
　　良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是老年男性的常見(jiàn)和多發(fā)性疾病。隨著人們生活水平的提高和人均壽命的延長(zhǎng)，其發(fā)病率正逐年上升。年齡的增長(zhǎng)和有功能睪丸的存在是BPH發(fā)病的必要條件，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年來(lái)，前列腺炎癥在BPH發(fā)病機(jī)制中的重要作用已引起了眾多關(guān)注，有學(xué)者提出BPH是一種免疫介導(dǎo)的炎性疾病。
　　Toll樣受體4(Toll like recepto

2、rs4，TLR4)是LPS的受體，在機(jī)體應(yīng)對(duì)病原微生物的先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TLR4不僅在各種免疫細(xì)胞上表達(dá)，還在各種上皮和內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)，作為機(jī)體先天性免疫的第一道防線。有文獻(xiàn)報(bào)道，TLR4信號(hào)可能參與前列腺上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生，從而促進(jìn)前列腺疾病的發(fā)生和進(jìn)展。
　　轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factor-β，TGF-β1)是一種多效性細(xì)胞因子，參與細(xì)胞重構(gòu)過(guò)程，如細(xì)胞增殖、凋亡、分

3、化及遷移。骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑(BMP and activin membrane-boundinhibitor, BAMBI)，作為T(mén)GF-β信號(hào)通路偽受體，可以與TGF-βⅠ型受體競(jìng)爭(zhēng)，阻止Ⅰ型與Ⅱ型受體及配體結(jié)合成功能性復(fù)合物，從而阻斷TGF-β信號(hào)的傳遞。關(guān)于BAMBI蛋白在人體各組織的表達(dá)已有文獻(xiàn)報(bào)道。然而，關(guān)于BAMBI蛋白在人體前列腺增生組織中的具體表達(dá)情況卻很少有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithe

4、lial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞失去極性，表現(xiàn)出遷移能力增強(qiáng)，在細(xì)胞基質(zhì)間能夠自由移動(dòng)且呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，在BPH組織，部分上皮細(xì)胞失去E-cadherin蛋白表達(dá)，同時(shí)獲得Vimentin蛋白表達(dá)，提示BPH發(fā)生發(fā)展過(guò)程中間質(zhì)細(xì)胞的積累可能來(lái)源于前列腺上皮細(xì)胞。TGF-β1被認(rèn)為是誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵因子，盡管TGF-β信號(hào)通路相對(duì)較簡(jiǎn)單，但其調(diào)節(jié)機(jī)制卻十分復(fù)雜。

5、目前，TGF-β信號(hào)通路的調(diào)控及其與其他信號(hào)通路的關(guān)系已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。
　　為了探討LPS/TLR4、BAMBI及TGF-β/Smad信號(hào)通路在前列腺增生EMT過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及相互作用機(jī)制，我們首先運(yùn)用免疫組化及免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè)了TLR4、BAMBI、p-Smad2/3在BPH組織中的表達(dá)及共定位。然后運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR、Western-blot及免疫組化技術(shù)檢測(cè)了LPS及TGF-β1刺激后BPH-1細(xì)胞EMT各項(xiàng)指

6、標(biāo)的表達(dá)情況，研究TLR4增強(qiáng)TGF-β-EMT信號(hào)通路的作用。最后運(yùn)用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建BAMBI高表達(dá)及低表達(dá)的BPH-1細(xì)胞系，探討TLR4通過(guò)下調(diào)BAMBI增強(qiáng)TGF-β/Smad-EMT信號(hào)通路的作用機(jī)制，為BPH的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。
　　[方法與結(jié)果]
　　1.TLR4、p-Smad2/3在合并炎癥的BPH組織中表達(dá)水平顯著上調(diào):采用免疫組化檢測(cè)62例BPH組織中TLR4、BAMBI及p-Smad2/3的表達(dá)

7、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在合并炎癥的47例BPH組織中TLR4及p-Smad2/3的表達(dá)顯著高于未合并炎癥的15例BPH組織，而B(niǎo)AMBI在合并炎癥及未合并炎癥的BPH組織中表達(dá)無(wú)顯著性差異(p＜0.05)。
　　2.在合并炎癥的BPH組織中，TLR4與BAMBI表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與p-Smad2/3表達(dá)呈正相關(guān):采用Spearman相關(guān)分析研究TLR4、BAMBI及p-Smad2/3在BPH組織中表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在單純BPH中，TLR4與

8、BAMBI、p-Smad2/3表達(dá)均無(wú)直線相關(guān)(r=-0.152、0.099，P=0.108、0.240)，BAMBI與p-Smad2/3蛋白表達(dá)呈弱的負(fù)相關(guān)(r=-0.298，P=0.041)。在合并炎癥的BPH中，TLR4與BAMBI表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.533，P=0.007)，TLR4與p-Smad2/3表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.308，P=0.015)，BAMBI與p-Smad2/3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.612，P=0.004

9、)。
　　3.TLR4與BAMBI、TLR4與p-Smad2/3在BPH組織中共表達(dá):采用免疫熒光雙染的細(xì)胞共定位技術(shù)檢測(cè)BPH組織中TLR4與BAMBI、TLR4與p-Smad2/3的同步表達(dá)和定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BPH組織中，特別是BPH上皮細(xì)胞中可以觀察到TLR4與BAMBI、TLR4與p-Smad2/3的同步表達(dá)和定位。
　　4.LPS/TLR4通過(guò)增強(qiáng)TGF-β/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)BPH-1細(xì)胞發(fā)生EMT:選取BP

10、H-1細(xì)胞株作為研究對(duì)象，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BPH-1細(xì)胞表達(dá)TLR4及BAMBI，且在LPS刺激后TLR4表達(dá)上調(diào)、BAMBI表達(dá)下調(diào)，但p-Smad2/3表達(dá)陰性。采用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot及免疫組化檢測(cè)各組EMT通路下游指標(biāo)的表達(dá)，結(jié)果顯示，10ug/ml LPS+0.1 ng/ml TGF-β1作用組E-cadherin的mRNA及蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照及陰性對(duì)照組(P＜0.05)，Vimentin及p-Sma

11、d2/3的mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照及陰性對(duì)照組(P＜0.05)。加入TLR4阻斷劑CLI-095后，10ug/ml LPS+0.1ng/mlTGF-β1下調(diào)E-cadherin及上調(diào)Vimentin、p-Smad2/3的作用被抑制(P＜0.05)。
　　5.LPS/TLR4信號(hào)下調(diào)BPH-1細(xì)胞BAMBI的表達(dá):運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR、Western Blot及免疫組化染色的方法檢測(cè)LPS刺激后BPH-1細(xì)胞BAMBI蛋白的

12、表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS作用組BAMBI的mRNA及蛋白表達(dá)含量顯著低于空白對(duì)照組及LPS+CLI-095共同作用組(P＜0.05)。
　　6.TLR4通過(guò)下調(diào)BAMBI增強(qiáng)TGF-β/Smad-EMT信號(hào)通路:采用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建了BAMBI蛋白低表達(dá)(AddnBambi)與過(guò)表達(dá)(AdBambi)的BPH-1細(xì)胞系，以未轉(zhuǎn)染BPH-1細(xì)胞作為空白對(duì)照。采用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot及免疫組化檢測(cè)各組EMT通

13、路下游指標(biāo)的表達(dá)。結(jié)果顯示，在10ug/ml LPS+0.1ng/ml TGF-β1作用后，AdBambi組的p-Smad2/3及Vimentin表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組，E-cadherin表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)，而AddnBambi組的p-Smad2/3、E-cadherin及Vimentin表達(dá)與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05）。
　　[結(jié)論]
　　1.在合并炎癥的BPH組織，TLR4及p-Smad

14、2/3的表達(dá)顯著上調(diào)，提示TLR4及TGF-β/Smad信號(hào)通路可能參與炎癥促進(jìn)BPH的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。
　　2.在合并炎癥的BPH組織中，TLR4與BAMBI表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與p-Smad2/3表達(dá)呈正相關(guān)，且TLR4與BAMBI、TLR4與p-Samd2/3在BPH組織上皮細(xì)胞共表達(dá)，提示TLR4與TGF-β/Smad信號(hào)通路之間可能通過(guò)BAMBI存在信號(hào)的交流。
　　3.人前列腺增生上皮BPH-1細(xì)胞可以表達(dá)TLR4及B

15、AMBI蛋白，不表達(dá)p-Smad2/3蛋白，且在LPS作用后TLR4表達(dá)上調(diào)、BAMBI表達(dá)下調(diào)，提示TLR4信號(hào)可能下調(diào)BAMBI表達(dá)。
　　4.LPS/TLR4可以通過(guò)增強(qiáng)TGF-β/Smad信號(hào)途徑誘導(dǎo)BPH-1細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　5.通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)可以構(gòu)建BAMBI過(guò)表達(dá)及低表達(dá)的BPH-1細(xì)胞系，過(guò)表達(dá)BAMBI可以抑制BPH-1細(xì)胞發(fā)生EMT。提示LPS/TLR4信號(hào)可以通過(guò)下調(diào)BAMBI蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)T