少突膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)發(fā)育與再生中的作用機(jī)制研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System，CNS)主要由兩類細(xì)胞組成——神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的間質(zhì)和支持細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、遷移、突觸聯(lián)系和神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)等均起到重要的調(diào)節(jié)作用，膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)已逐漸成為當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞主要有三類:星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。本研究主要關(guān)注少突膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及損傷后修復(fù)中的相關(guān)作用機(jī)制。
　　 少突膠質(zhì)細(xì)胞(

2、oligodendrocytes，OLs)由少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyteprecursor cells，OPCs)經(jīng)過增殖、遷移、分化形成，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)唯一的成髓鞘細(xì)胞。在脊椎動(dòng)物，神經(jīng)系統(tǒng)中軸突髓鞘化的順利完成以及髓鞘的完整性是維持軸突絕緣和實(shí)現(xiàn)動(dòng)作電位跳躍式傳導(dǎo)的重要保證，在進(jìn)化上具有重要意義。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及修復(fù)所涉及到的髓鞘化過程中，少突膠質(zhì)細(xì)胞的遷移扮演了重要的角色。然而，精確調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞遷移的細(xì)

3、胞外和細(xì)胞內(nèi)機(jī)制目前尚未研究清楚。近年來的研究顯示，Slits蛋白家族可通過與其受體Robos的結(jié)合，調(diào)節(jié)諸多神經(jīng)發(fā)育過程中的事件，例如細(xì)胞的遷移、粘附、軸突導(dǎo)向和延伸。Slit2在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元區(qū)域具有高表達(dá)，而這一區(qū)域正是OPCs產(chǎn)生的區(qū)域;Slit2在大鼠腹側(cè)脊髓維持高表達(dá)水平而在背側(cè)脊髓低表達(dá)。這些空間表達(dá)特征提示，Slit2有可能參與了對(duì)OPCs遷移過程的調(diào)節(jié)，然而迄今尚未見Slit2在OPCs遷移中的作用的研究報(bào)道。
　　

4、 OLs通過形成髓鞘，促進(jìn)神經(jīng)沖動(dòng)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并維持軸突完整性。神經(jīng)損傷后，髓鞘崩解，并釋放多種降解產(chǎn)物，能夠抑制神經(jīng)軸突的再生。這些降解產(chǎn)物被稱為髓鞘相關(guān)抑制因子(myelin-associated inhibitory factors，MAIFs)。目前已鑒定出五個(gè)MAIFs，其中Nogo、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)以及少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte m

5、yelin glycoprotein，OMgp)能夠直接與同一個(gè)受體，Nogo受體復(fù)合物，結(jié)合并發(fā)揮功能。最初鑒定的Nogo受體復(fù)合物由三個(gè)部分組成:Nogo受體(NgR)、p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor，p75)和LINGO-1，之后的研究發(fā)現(xiàn)，TROY受體可以功能性地替代p75，參與組成Nogo受體復(fù)合物，即構(gòu)成NgR/TROY/LINGO-1受體復(fù)合物。這一三聯(lián)受體復(fù)合物與配體結(jié)合后，激

6、活其下游的小G蛋白R(shí)hoA GTP酶，引起神經(jīng)元生長錐塌陷、軸突再生抑制。目前已知神經(jīng)突起生長的抑制依賴于TROY介導(dǎo)的RhoA激活，但TROY是通過何種機(jī)制激活其下游的RhoA，迄今尚不清楚。
　　 本研究運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)手段，對(duì)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的遷移機(jī)制以及髓鞘相關(guān)抑制因子的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，旨在深入認(rèn)識(shí)神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞相互作用機(jī)制，以期為設(shè)計(jì)與開發(fā)促進(jìn)神經(jīng)再生與修復(fù)的策略開創(chuàng)新思路。本研究取得的主要結(jié)果如下:
　　

7、1.軸突導(dǎo)向分子Slit2通過Fyn-RhoA信號(hào)通路調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的遷移
　　 我們的研究顯示:(1)運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)、RT-PCR及Western-Blot實(shí)驗(yàn)方法，明確了在體外培養(yǎng)的以及體內(nèi)OPCs中均表達(dá)Robos受體;(2)運(yùn)用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Slit2可以排斥OPCs的遷移，并且這種排斥效應(yīng)與Slit2的濃度有關(guān);(3)運(yùn)用Robos受體的特異性抑制物RoboN進(jìn)行Transw

8、ell小室遷移實(shí)驗(yàn)，可以顯著減弱Slit2的這一效應(yīng);(4)用Slit2蛋白處理體外培養(yǎng)的OPCs，觀察到OPCs中Fyn活化水平降低，而RhoA的活化水平升高;(5)運(yùn)用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Co-IP)發(fā)現(xiàn)，OPCs中的Fyn可與Robo1相互作用，并且，對(duì)OPCs給予Slit2刺激后，F(xiàn)yn和Robo1的結(jié)合強(qiáng)度下降。本部分結(jié)果表明，Slit2與其受體Robo1的結(jié)合能夠通過Fyn和RhoA信號(hào)通路調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的遷移。
　

9、　 2.TROY受體與RhoGDIα的相互作用參與了Nogo-66介導(dǎo)的神經(jīng)突起生長抑制作用
　　 我們的研究顯示:(1)利用GST(glutathione S-transferase，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)pull-down技術(shù)聯(lián)合二維電泳、質(zhì)譜分析，鑒定出RhoGDIα是TROY的一個(gè)結(jié)合分子;采用免疫共沉淀(Co-IP)的方法在體外培養(yǎng)的細(xì)胞和組織水平進(jìn)一步確證了TROY與RhoGDIα的結(jié)合;(2)缺失突變分析結(jié)果顯示，

10、TROY胞內(nèi)段(ICD)的234-356aa(amino acids)和321-350 aa兩段序列介導(dǎo)了TROY與RhoGDIα的結(jié)合;(3)運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)方法，在出生后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊髓背根神經(jīng)元(DRG)、大腦皮層神經(jīng)元以及小腦顆粒神經(jīng)元(cerebellar granule neurons，CGNs)中均檢測(cè)到了TROY和RhoGDIα的共定位;(4) Nogo-66能夠增強(qiáng)TROY/RhoGDIα的相互作用，

11、且TROY/RhoGDIα的相互作用是p75非依賴性的;(5)在p75基因敲除小鼠的神經(jīng)元中，TROY/RhoGDIα的相互作用仍然可介導(dǎo)RhoA的激活;(6)在野生型和p75敲除的小腦顆粒神經(jīng)元中過表達(dá)RhoGDIα能夠阻斷Nogo-66介導(dǎo)的RhoA的激活以及隨后的神經(jīng)突起生長抑制。本部分結(jié)果表明，RhoGDIα與TROY的相互作用參與了Nogo-66介導(dǎo)的依賴于TROY的RhoA活化，并抑制了神經(jīng)突起生長。
　　 綜上所述