2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一類引起人和初生動物患病的重要病原菌。人或動物被ETEC感染后,常因嚴(yán)重腹瀉和脫水而死亡,發(fā)病率和死亡率都很高,給養(yǎng)殖業(yè)和食品安全領(lǐng)域帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。本實驗從150份市售豬肉樣品和養(yǎng)殖場豬糞中分離ETEC,通過生理生化指標(biāo)和分子生物學(xué)手段鑒定該菌株,利用特異性引物分離ETEC單菌落并進(jìn)行純化,以分離得到的單菌落為宿主菌,篩選裂解性噬菌體,

2、然后考察噬菌體的生物學(xué)特性,為噬菌體的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
  將豬肉樣品用均漿機打碎并稀釋,豬糞樣品預(yù)處理后在腦心浸出液肉湯中增菌,然后涂布于選擇性培養(yǎng)基麥康凱中培養(yǎng),觀察菌落形態(tài)。分離純化后的優(yōu)勢菌菌落顏色為桃紅色,菌落形態(tài)呈表面隆起、邊緣整齊、光滑、圓潤等特征。然后,提取混合菌液的總DNA,用設(shè)計合成的5種引物和探針,進(jìn)行 MRT-PCR反應(yīng),對于陽性樣品保留作下一步的實驗;將PCR擴增獲得的16S rDNA片段(1436bp)進(jìn)

3、行系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明與大腸桿菌屬有99%的同源性,可以判定為大腸桿菌屬。對陽性混合菌液中的疑似ETEC進(jìn)行生理生化鑒定,分離的致病菌具有運動性,能夠分解代謝鳥氨酸、賴氨酸、色氨酸、尿素、苯丙氨酸、甘露醇、肌醇、蜜二糖、棉子糖,不能分解代謝山梨醇、核糖醇。利用LT基因、ST基因的引物進(jìn)行特異性PCR反應(yīng),從陽性混合菌樣品中分離ETEC單菌落并純化,對分離得到的ETEC進(jìn)行耐藥性分析以及外膜囊泡的分離鑒定,進(jìn)一步驗證其特征。結(jié)果表明,150

4、個豬源樣品中共分離得到7株ETEC,其中3株只攜帶LT基因,2株只攜帶ST基因,2株既攜帶LT基因又?jǐn)y帶ST基因,可以初步判定其中2株既攜帶LT基因又?jǐn)y帶ST基因的ETEC的致病性比其他菌株強。對分離得到的ETEC進(jìn)行耐藥性分析,選擇10種常用的抗生素,檢測ETEC菌株的耐藥性,結(jié)果表明,ETEC對環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、阿莫西林極度敏感,對鏈霉素、四環(huán)素高度敏感,對氯霉素、多西環(huán)素中度敏感,對多粘菌素B和慶大霉素產(chǎn)生抗性。采用超濾離心法

5、分離ETEC產(chǎn)生的外膜囊泡,并用透射電鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示,ETEC的外膜囊泡約為100 nm,呈圓形或橢圓形。
  利用兩株既攜帶LT基因又?jǐn)y帶ST基因的ETEC-1和ETEC-2作為宿主菌,采集養(yǎng)殖場和醫(yī)院的廢水,經(jīng)離心、過濾等處理得到ETEC-1的噬菌體原液;將噬菌體原液接種到對數(shù)生長期菌液中培養(yǎng),過濾除菌,得到高效價噬菌體增殖液。通過雙層平板法分離純化得到兩株噬菌體,命名為PES-1和PES-2。透射電鏡觀察結(jié)果顯示,分離

6、的兩株噬菌體(PES-1和PES-2)屬于長尾科噬菌體(Siphoviridae)。通過體外抑菌實驗、一步生長曲線、pH、溫度穩(wěn)定性、氯仿敏感性實驗,以及噬菌體顆粒濃縮來確定噬菌體的生物學(xué)特性。提取噬菌體基因組DNA,進(jìn)行酶切反應(yīng),參與酶切的限制性內(nèi)切酶:Xho I、EcoR I、BamH I、HindIII。酶切實驗表明,PES-1的基因組為線性DNA,PES-2的基因組DNA為環(huán)形。PES-1的裂解能力優(yōu)于PES-2,PES-1和P

7、ES-2共同作用時,可以顯著抑制病原菌的生長。
  將 SDS和膽鹽按照不同的濃度梯度加入噬菌體與宿主菌中,測定其菌液的 OD600的值,與只加噬菌體和只加抗生素的空白對照組作對比,結(jié)果表明,SDS和膽鹽都使噬菌體的裂解能力有不同程度的下降;如果將噬菌體口服灌胃施用,膽鹽作為哺乳動物腸道內(nèi)分泌物,噬菌體必會受到膽鹽的影響,因此,噬菌體口服施用時應(yīng)包被。噬菌體—抗生素聯(lián)合應(yīng)用是控制耐藥菌感染、控制菌株抗性進(jìn)化的有效方法。將不同濃度的

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