蒙藥忠倫阿湯對CIA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞抗增殖作用及其調(diào)節(jié)JAK-STAT信號通路的研究.pdf

1、第一部分：忠倫阿湯對CIA大鼠的療效觀察
　　目的：觀察及評價(jià)忠倫阿湯對CIA大鼠的療效。
　　方法：選用健康成年雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，隨機(jī)選取10只作為正常組（normal），其余采用牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組（model）、忠倫阿湯高劑量組（zhongl hd）、忠倫阿湯中劑量組（zhongl md）、忠倫阿湯低劑量組（zhongl ld）

2、、甲氨蝶呤組（MTX）和苦參堿組（matrine）。在初次免疫后第11天開始灌胃給藥，正常組、模型組予生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥6周。觀察大鼠體重、足跖厚度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)及大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)改變。
　　結(jié)果：忠倫阿湯高、中劑量組及苦參堿組可降低CIA大鼠右后足跖厚度及關(guān)節(jié)指數(shù)評分，可緩解關(guān)節(jié)炎對體重的影響，光鏡下觀察，模型組大鼠滑膜組織增生明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤，軟骨破壞，無骨破壞；忠倫阿湯高劑量組顯示滑膜組織無增生，炎性細(xì)胞浸潤少，無軟

3、骨侵蝕及骨破壞；忠倫阿湯中劑量組、苦參堿組滑膜組織輕度增生，少量炎性細(xì)胞浸潤，無軟骨侵蝕，無骨破壞；忠倫阿湯低劑量組滑膜組織層增多，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，局部軟骨破壞，無骨破壞。
　　結(jié)論：忠倫阿湯及苦參堿對CIA大鼠有明顯的治療作用。
　　第二部分：忠倫阿湯對CIA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡的影響
　　目的：觀察忠倫阿湯對CIA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：大鼠分組給藥同第一部分。灌胃6周后，處死大鼠，取膝關(guān)節(jié)滑膜組織

4、，免疫組織化學(xué)法檢測滑膜組織中Bax、Bcl-2、caspase-3的表達(dá)。
　　結(jié)果：與正常組比較，模型組 Bax、caspase-3表達(dá)明顯減少，而Bcl-2表達(dá)明顯增加，而忠倫阿湯和苦參堿可使Bax、caspase-3表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少；與MTX組比較，忠倫阿湯高劑量組Bax、Bcl-2、caspase-3表達(dá)無明顯差異。
　　結(jié)論：忠倫阿湯及苦參堿能促進(jìn)CIA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡。
　　第三部分：忠倫阿湯

5、對CIA大鼠滑膜細(xì)胞JAK/STAT信號通路的影響
　　目的：觀察忠倫阿湯對CIA大鼠滑膜細(xì)胞中JAK/STAT信號通路活化及下游cyclin D1表達(dá)的影響。
　　方法：大鼠分組給藥同第一部分。灌胃6周后，處死大鼠，取滑膜組織，免疫印跡（Western Blot，WB）方法檢測各組滑膜細(xì)胞中P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3及cyclin D1的表達(dá)。
　　結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠 P-JAK2、P-

6、STAT1、P-STAT3及 cyclin D1表達(dá)明顯增高，而忠倫阿湯和苦參堿可抑制其表達(dá)；與MTX組相比，忠倫阿湯高劑量組p-STAT1、p-STAT3表達(dá)明顯升高，而P-JAK2、cyclin D1表達(dá)無明顯差異。
　　結(jié)論：忠倫阿湯及苦參堿可抑制CIA大鼠滑膜JAK/STAT信號通路的活化。
　　第四部分：忠倫阿湯含藥血清對體外培養(yǎng)的CIA大鼠FLS增殖凋亡的影響
　　目的：觀察忠倫阿湯含藥血清及苦參堿對體外培

7、養(yǎng)的CIA大鼠FLS增殖與凋亡的影響。
　　方法：CIA大鼠分離、鑒定FLS，采用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定忠倫阿湯含藥血清/苦參堿的半抑制濃度（IC50），以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。Annexin V-FITC和PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。WB方法檢測大鼠FLS中Bax、Bcl-2、caspase-3及cyclin D1蛋白表達(dá)水平。熒光定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR)方法檢測大鼠FLS中Bax、Bcl-

8、2、caspase-3 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：CCK-8法結(jié)果顯示，忠倫阿湯含藥血清和苦參堿呈劑量-時(shí)間依賴性的抑制FLS活性，忠倫阿湯含藥血清和苦參堿的IC50分別為20%、0.75mg/ml。
　　模型組Bax、caspase-3 mRNA和蛋白水平、G0/G1期百分比、細(xì)胞總調(diào)亡率明顯降低，Bcl-2、cyclin D1 mRNA和蛋白水平、增殖指數(shù)顯著升高，提示模型組FLS過度增值（P＜0.05）；與模型組相比

9、，忠倫阿湯含藥血清和苦參堿明顯抑制這一過程（P＜0.05），苦參堿對Bax蛋白表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：忠倫阿湯含藥血清及苦參堿可抑制CIA大鼠FLS增殖，誘導(dǎo)其凋亡。
　　第五部分：忠倫阿湯含藥血清對體外培養(yǎng)的 CIA大鼠 FLS JAK/STAT信號通路的影響
　　目的：觀察忠倫阿湯含藥血清及苦參堿對體外培養(yǎng)的CIA大鼠FLS中 JAK/STAT信號通路活化的影響。
　　方法：FLS培養(yǎng)，分

10、組同第四部分。采用 WB方法檢測細(xì)胞中P-JAK2、P-STAT1、P-STAT3蛋白表達(dá)，qRT-PCR檢測細(xì)胞中JAK2、STAT1、STAT3mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：與正常組比較，模型組JAK2、STAT1、STAT3蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。當(dāng)加入 JAK/STAT通路抑制劑AG490時(shí)，通路明顯被抑制（P＜0.05）。忠倫阿湯含藥血清和苦參堿能顯著下調(diào)模型組FLS中JAK2、STAT1、STAT3蛋白水平，抑制