TLR4配體脂多糖和紫杉醇對Lewis肺癌小鼠脾臟來源CD11b+Gr-1+MDSCs的作用.pdf

1、免疫療法在腫瘤治療中日漸興起，然而臨床效果卻不令人滿意，其原因之一在于腫瘤誘導(dǎo)的免疫耐受。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫耐受的產(chǎn)生與髓系來源抑制性細(xì)胞(MDSCs)的聚集相關(guān)。MDSCs是一類具有免疫抑制活性的細(xì)胞群體，能通過多種方式抑制機(jī)體免疫，包括表達(dá)免疫抑制活性酶類。MDSCs一旦在腫瘤微環(huán)境中發(fā)生分化受阻、聚集，將不利于機(jī)體的抗腫瘤免疫。目前關(guān)于MDSCs的產(chǎn)生、分化及功能的調(diào)控是腫瘤免疫學(xué)的研究重點(diǎn)。
　　Toll樣受體4(TLR4)

2、是重要的免疫分子，能識別細(xì)菌外膜成分脂多糖(LPS)，主要分布在髓系細(xì)胞表面，參與調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞的免疫功能。近來有報道稱在4T1乳腺癌荷瘤小鼠及正常小鼠體內(nèi)的MDSCs表面也發(fā)現(xiàn)了TLR4表達(dá)，并認(rèn)為TLR4可能是MDSCs產(chǎn)生、分化及功能的潛在調(diào)控靶點(diǎn)。細(xì)胞毒藥物紫杉醇是新近發(fā)現(xiàn)的TLR4的潛在配體，研究認(rèn)為紫杉醇可能通過調(diào)控表達(dá)TLR4的免疫細(xì)胞參與機(jī)體的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)，并且已在樹突狀細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究中得到證實(shí)，那么，紫杉醇是

3、否也能通過影響表達(dá)TLR4的MDSCs來調(diào)節(jié)宿主的免疫功能?并且，同樣作為TLR4的配體，紫杉醇與LPS對MDSCs的作用有何異同?均有待闡明。故本課題擬首先鑒定并分選Lewis肺癌小鼠脾臟中的MDSCs，了解此來源的MDSCs上TLR4的表達(dá)狀況，檢測LPS及紫杉醇處理后MDSCs凋亡、成熟和免疫功能的變化，本課題的研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步闡明TLR4與MDSCs間的關(guān)系，并對紫杉醇的抗腫瘤免疫功能提供新的認(rèn)識。
　　研究方法：<

4、br>　　1.熒光抗體標(biāo)記Lewis肺癌小鼠及正常小鼠脾臟單個核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞表面分子CD11b和Gr-1、分化抗原CD11c和F4/80、組織相容性復(fù)合物MHC-Ⅱ、協(xié)同共刺激分子CD86的表達(dá)。(鑒定MDSCs的表面標(biāo)志)。
　　2.利用相應(yīng)的免疫磁珠分選Lewis肺癌小鼠脾臟中的MDSCs。
　　3.建立混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系(MLR)，體外鑒定分選所得MDSCs的免疫抑制功能。
　　4.RT-

5、PCR檢測MDSCs中TLR4基因的表達(dá)；FCM檢測MDSCs表面TLR4蛋白的表達(dá)。
　　5.AnnexinV+PI法檢測LPS及紫杉醇作用后MDSCs的凋亡；FCM檢測Lewis肺癌小鼠腹腔注射紫杉醇后其脾臟中MDSCs比例的變化。
　　6.FCM檢測LPS及紫杉醇作用后MDSCs表面組織相容性復(fù)合物MHC-Ⅱ及協(xié)同共刺激分子CD86的表達(dá)。
　　7.MLR檢測LPS及紫杉醇作用后MDSCs的免疫抑制功能。

6、　　8.Western Blot檢測LPS及紫杉醇處理后MDSCs胞內(nèi)免疫抑制活性酶類精氨酸酶1(ARG1)的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1.Lewis肺癌小鼠脾臟內(nèi)CD11b/Gr-1雙陽性細(xì)胞明顯增多，占脾臟單個核細(xì)胞的(42.53±6.26)％。Lewis肺癌小鼠脾臟來源CD11b/Gr-1雙陽性細(xì)胞表面CD11c、F4/80、MHC-Ⅱ及CD86的表達(dá)均較正常小鼠低，分別為(11.67±3.01)％vs(24.67±

7、4.02)％，p=0.01；(14.33±3.33)％vs(27.00±4.21)％，p=0.01；(8.66±2.33)％vs(30.00±3.51)％，p=0.001；(14.67±3.76)％vs(32.00±4.73)％，p=0.007。
　　2.免疫磁珠分選所得陽性細(xì)胞中CD11b/Gr-1雙陽性細(xì)胞比例大于90％，而分選所得陰性細(xì)胞中CD11b/Gr-1雙陽性細(xì)胞少于1％。
　　3.與對照組相比，包含Lewis肺

8、癌小鼠脾臟來源CD11b/Gr-1雙陽性細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組中淋巴細(xì)胞的增殖率明顯降低，(14.67±3.76)％vs(45.30±7.26)％，p=0.02。
　　4.Lewis肺癌小鼠脾臟來源CD11b+Gr-1+MDSCs表面存在TLR4表達(dá)。
　　5.0.1gg/ml LPS或1μg/ml LPS作用48小時后CD11b+Gr-1+MDSCs的凋亡較對照組降低，分別為(9.83±2.36)％vs(23.93±4.67)％，p

9、0.1μg/ml=0.007；(8.00±2.64)％vs(23.93±4.67)％，P1μg/ml=0.004，而不同濃度LPS組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)LPS作用24小時后，三組間凋亡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6.1μg/ml LPS作用后CD11b+Gr-1+MDSCs表面MHC-Ⅱ和CD86的表達(dá)較對照組降低，分別為(15.33±3.78)％vs(34.66±3.78)％，PMHC-Ⅱ=0.002；(18.48±3.51)％v

10、s(31.23±3.60)％，PCD86=0.01。而0.1μg/ml LPS作用后MHC-Ⅱ和CD86的表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　7.1μg/ml LPS作用后CD11b+Gr-1+MDSCs對淋巴細(xì)胞增殖的抑制較對照組增加，抑制率分別為(44.33±9.71)％vs(19.33±5.52)％，P1:1=0.01；(34.66±7.76)％vs(17.66±4.52)％，p1:2=0.03(1:1和1:2為CD11

11、b+Gr-1+MDSCs在MLR中的稀釋比例)。而0.1μg/ml LPS組與對照組相比抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　8.0.1μg/ml LPS或1μg/ml LPS均能誘導(dǎo)CD11b+Gr-1+MDSCs胞內(nèi)免疫抑制酶類ARG1表達(dá)增高。
　　9.Lewis肺癌小鼠腹腔注射20mg/kg紫杉醇后脾臟中CD11b+Gr-1+MDSCs的比例較未注射組降低，(28.64±5.45)％vs(42.58±5.06)％，p=0.0

12、3。
　　10.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇作用后CD11b+Gr-1+MDSCs的凋亡均較對照組增加，凋亡率分別為(21.46±6.76)％vs(4.53±0.90)％，P24小時/30ng/ml=0.01；(38.96±5.47)％vs(4.53±0.90)％，p24小時/300ng/ml=0.001；(38.70±4.21)％vs(23.93±4.67)％；P48小時/30ng/ml=0.04；(55.03±

13、6.65)％vs(23.93±4.67)％，P48小時/300ng/ml=0.009。不同濃度紫杉醇組間MDSCs的凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)差異，P24小時=0.01、p48小時=0.02。
　　11.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇作用后CD11b+Gr-1+MDSCs表面MHC-Ⅱ的表達(dá)分別為(36.34±5.35)％、(42.12±5.56)％，CD86的表達(dá)分別為(42.00±6.35)％、(31.12±4.83)

14、％，與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　12.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇作用后CD11b+Gr-1+MDSCs對淋巴細(xì)胞增殖的抑制較對照組降低，抑制率分別為(12.0±4.87)％vs(25.56±6.56)％，P30ng/ml=0.04；(10.22±4.52)％vs(25.56±6.56)％，p300ng/ml=0.02。
　　13.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇均不會影響CD11b+G

15、r-1+MDSCs胞內(nèi)ARG1的表達(dá)。
　　研究結(jié)論：
　　1.與正常小鼠相比，Lewis肺癌小鼠脾臟中聚集了大量的CD11b/Gr-1雙陽性細(xì)胞，且該雙陽性細(xì)胞分化受阻、成熟障礙，并在體外能抑制淋巴細(xì)胞的增殖，符合MDSCs的生物特征。
　　2.Lewis肺癌小鼠脾臟來源CD11b+Gr-1+MDSCs表面存在TLR4的表達(dá)。TLR4配體LPS作用后能增加CD11b+Gr-1+MDSCs在體外的抗凋亡能力，抑制CD1