肺癌紫杉醇耐藥的實驗及臨床研究.pdf

1、第一部分 背景與目的：非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是常見的惡性腫瘤，化學藥物治療(簡稱化療)是肺癌綜合治療的一個重要部分。腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是影響肺癌化療療效的主要障礙之一。紫杉醇(paclitaxel)作為一種新型的抗腫瘤藥物，在NSCLC治療上已顯示出良好的發(fā)展前景。然而，其耐藥性的產(chǎn)生以及越來越多交叉耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，已成為一道

2、不容忽視的難題。因此，闡明其耐藥機制，對于更好地選用治療策略、篩選合適病人節(jié)約醫(yī)療資源、最大限度地避免或逆轉(zhuǎn)耐藥性的產(chǎn)生及化療療效的提高具有十分重要的意義。紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生是一個多途徑過程，而體外建立多藥耐藥細胞系是研究腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥機制的重要手段。為了更深入地探討非小細胞肺癌紫杉醇耐藥產(chǎn)生機制，本研究擬構(gòu)建耐紫杉醇的人肺腺癌細胞系，為后面耐藥相關蛋白的研究打下基礎。 方法：應用抗腫瘤藥物紫杉醇(泰素，taxol)以體外

3、濃度遞增和短時作用法誘導人肺腺癌A549細胞株。用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞的耐藥指數(shù)及對多種抗癌藥物的敏感性；測定細胞群體倍增時間和細胞生長曲線；免疫組織化學檢測P-糖蛋白(P-gp)、β-微管蛋白(β-tubulin)、GST-π、ERCC1、P53等耐藥相關蛋白的表達；RT-PCR檢測III型β微管蛋白在親代及耐藥細胞中mRNA的表達情況。 結(jié)果：經(jīng)過15個月逐步增加劑量的藥物誘導和克隆篩選，建立了能夠在Img/L

4、紫杉醇濃度下長期培養(yǎng)生長的細胞株，命名為人肺腺癌紫杉醇耐藥株A549/Taxol。經(jīng)MTT法檢測，A549/Taxol細胞的紫杉醇半數(shù)抑制濃度(IC50)是親代A549細胞的512.8倍，群體倍增時間是親代細胞的1.28倍，對紫杉醇、絲裂霉素、長春新堿、諾維苯的耐藥指數(shù)依次為512.8、66.48、4.88、2.66，表現(xiàn)為典型的MDR表型；而對順鉑、健擇無交叉耐藥。免疫組化檢測見A549/Taxol細胞中高表達P-糖蛋白、β-微管蛋白

5、。RT-PCR檢測III型β-微管蛋白在耐藥細胞中mRNA表達高于其親代細胞系。 結(jié)論：建立了穩(wěn)定耐紫杉醇的A549/Taxol，并呈多藥耐藥特性。其耐藥機制可能與P-糖蛋白(P170)、β-微管蛋白等蛋白表達水平增高有關。 第二部分 背景與目的：既往大量的研究結(jié)果提示紫杉醇耐藥現(xiàn)象的發(fā)生不是由單一基因或蛋白改變所引起，而可能是由多種蛋白網(wǎng)絡式共同作用的結(jié)果。本實驗在第一部分建立了肺腺癌耐紫杉醇細胞株，因此本研究

6、擬在前期實驗的基礎上，應用高通量篩查差異表達蛋白的實驗技術——蛋白質(zhì)組學技術比較人肺腺癌細胞株(A549)和紫杉醇耐藥細胞株(A549/Taxol)間差異蛋白的表達，擬發(fā)現(xiàn)與肺癌耐紫杉醇相關的特異蛋白標志物，希望能對非小細胞肺癌紫杉醇耐藥機制進行探討，為今后尋找非小細胞肺癌的治療靶點或逆轉(zhuǎn)耐藥提供理論依據(jù)。 方法：提取非小細胞肺癌細胞株A549及紫杉醇耐藥細胞株A549-Taxol的總蛋白，應用雙向凝膠電泳技術(2-DE)分離，

7、獲得二者高質(zhì)量的蛋白表達譜，經(jīng)Imagemaster5.0軟件比較分析，篩選出二者間差異表達的蛋白點，通過質(zhì)譜鑒定差異蛋白。應用Western blot技術對篩選出的CK18蛋白作進一步驗證。 結(jié)果：獲得了分辨率高、重復性好的肺癌耐紫杉醇細胞系及親代細胞系雙向電泳圖譜。Imagemaster軟件分析獲得差異大于2倍以上的蛋白質(zhì)點共有80個，其中33個在耐藥細胞系中上調(diào)，47個下調(diào)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定了20種蛋白，鑒定的蛋白涉及細胞骨架蛋

8、白、代謝酶類、分子伴侶和信號轉(zhuǎn)導相關蛋白等。差異明顯的蛋白中，β-微管蛋白在紫杉醇耐藥中研究比較成熟，而CK18蛋白與紫杉醇耐藥關系的文獻較少，由此考慮CK18可能為肺癌紫杉醇耐藥的新靶點，應用Western blot技術對它作進一步驗證，發(fā)現(xiàn)CK18表達水平在紫杉醇耐藥細胞株中較親本株中升高。 結(jié)論：非小細胞肺癌細胞株A549及紫杉醇耐藥細胞株A549-Taxol相比，有許多蛋白在表達水平發(fā)生了顯著改變。應用雙向電泳技術整體展

9、示了紫杉醇耐藥細胞株及敏感細胞株的蛋白表達譜，并分析、鑒定、篩選出與紫杉醇耐藥相關的差異蛋白，為進一步從多因素角度研究認識紫杉醇耐藥機制提供了新的線索。通過Western blot對CK18鑒定獲得了滿意的CK18蛋白免疫印跡圖譜，推測此蛋白有望成為肺癌紫杉醇耐藥的新靶點。 第三部分 背景與目的：本研究第二部分通過對A549肺癌細胞株及A549/Taxol紫杉醇耐藥細胞株的總蛋白提取，應用雙向凝膠電泳(2-DE)技術獲得

10、了高質(zhì)量的蛋白表達譜，經(jīng)Imagemaster5.O軟件比較分析、質(zhì)譜鑒定出了差異蛋白，通過Western blot再次驗證，確認CK18為差異明顯的蛋白之一。由于前期研究發(fā)現(xiàn)CK18作為腫瘤治療療效預測因子已能在外周血清中測得，基于以上理論及實驗依據(jù)，本部分擬前瞻性地獲取晚期非小細胞肺癌紫杉醇化療患者耐藥前后外周血，作為自身對照以ELISA法檢測其中的CK18水平，來評價CK18與紫杉醇耐藥的關系，并為第二部分作進一步的臨床驗證。

11、 方法：20例晚期非小細胞肺癌患者，紫杉醇175mg/m2，dl靜脈滴入、卡鉑以AUC=5計算用量dl靜脈滴入，21天為一個周期，2～6個周期。按RECIST標準評定療效。在患者化療一個周期后評價療效為病情穩(wěn)定(SD)或以上，抽取外周血5ml抗凝，予以規(guī)范化療，每周期后重新評價療效，直到出現(xiàn)病情進展(PD)后再次抽取外周血5ml抗凝。酶聯(lián)免疫吸附法檢測耐藥前后血清中CK18含量作為自身對照。 結(jié)果：20例患者耐藥前血清CK1

12、8水平為0.3559±0.1990ng/ml；耐藥后為0.5656±0.1893ng/ml。4例患者血清CK18水平略有下降(<20％)，但都為化療2次，即抽血后第一次評價療效時出現(xiàn)耐藥；其余16例全部都出現(xiàn)升高(化療2次以上出現(xiàn)耐藥)，其中13例增高大于20％，最高達947.17％。配對t檢驗顯示P=0.006，兩組差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論：CK18的檢測有助于預測紫杉醇化療的療效，并且對獲得性耐藥意義可能更大，可以為晚期N