氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)研究.pdf

1、水產(chǎn)藥物殘留問(wèn)題普遍存在，給人類健康和環(huán)境帶來(lái)了很大的危害。進(jìn)入養(yǎng)殖環(huán)境的抗菌藥物可引起養(yǎng)殖生物自身和養(yǎng)殖水環(huán)境中耐藥細(xì)菌和耐藥基因的產(chǎn)生，破壞生態(tài)平衡，威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的可持續(xù)安全；同時(shí)養(yǎng)殖生物體內(nèi)殘留的漁藥和某些耐藥細(xì)菌及耐藥基因可通過(guò)食物鏈的傳遞進(jìn)入人體，給人類健康帶來(lái)潛在的威脅。
　　氟苯尼考以其高效、吸收迅速、分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)，作為氯霉素替代物，用于近海養(yǎng)殖中，尤其是在蝦類養(yǎng)殖及育苗中的廣泛使用。然而，由此引起的氟苯尼考?xì)?/p>

2、留現(xiàn)象及細(xì)菌耐藥性不斷產(chǎn)生并呈現(xiàn)逐年攀升現(xiàn)象。因此，進(jìn)行水產(chǎn)品氟苯尼考藥殘危害和海水源弧菌對(duì)氟苯尼考的耐藥性監(jiān)測(cè)研究迫在眉睫。脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)是我國(guó)新興的海水養(yǎng)殖品種發(fā)展迅速，其作為與魚蟹貝類等混養(yǎng)的重要經(jīng)濟(jì)蝦類，顯示出良好的養(yǎng)殖前景。本課題以脊尾白蝦為研究對(duì)象，研究了不同溫度、不同給藥方式下氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征；測(cè)定了給藥劑量下氟苯尼考在脊尾白蝦各組織中的殘留規(guī)律；以脊尾白蝦

3、解剖學(xué)參數(shù)和氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的藥殘參數(shù)構(gòu)建了氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)殘留的PBPK模型，以凡納濱對(duì)蝦相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型參數(shù)優(yōu)化并進(jìn)行種間類推；進(jìn)行了氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的藥效和危害評(píng)價(jià)；檢測(cè)了三種不同養(yǎng)殖模式蝦池中弧菌對(duì)氟苯尼考的耐藥性水平。本論文研究?jī)?nèi)容共分為以下六部分：
　　1.不同溫度和給藥方式下氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較
　　在水溫(22±0.4)℃和(28±0.3)℃條件下，分別以10 mg/(kg

4、·BW)和30 mg/(kg·BW)給藥劑量經(jīng)肌注和口服氟苯尼考后，用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定了脊尾白蝦各組織中氟苯尼考濃度，通過(guò) DAS2.0藥動(dòng)學(xué)軟件對(duì)氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的血藥濃度進(jìn)行分析，擬合出藥動(dòng)曲線方程，比較不同水溫和給藥方式下氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)差異，并給出不同水溫條件下的給藥方案。結(jié)果可知，不同水溫條件下健康脊尾白蝦肌注給藥時(shí)，氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)均符合零級(jí)吸收二室開(kāi)放模型，動(dòng)力學(xué)方程為：Ct肌注22

5、℃=5.362e-0.69t+2.53e-0.038t和 Ct肌注28℃=12.466e-1.569t+4.417e-0.065t；口服給藥時(shí)，氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)均符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型，動(dòng)力學(xué)方程為：Ct口服22℃=5.753e-0.191t+0.704e-0.036t-6.457e-1.743t和 Ct口服28℃=2.337e-0.442t+3.802e-0.061t-6.139e-40.223 t。在相同的給藥方式，不同水溫

6、條件下，氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的代謝差異較大：肌注給藥方式下，在22℃時(shí)氟苯尼考在脊尾白蝦血漿中Cmax(9.44μg/mL)和AUC0~t(75.779 h·mg/L)小于28℃水溫(16.79μg/mL和80.81 h·mg/L)，且t1/2α(1.004 h)和t1/2β(18.26 h)長(zhǎng)于28℃水溫(0.442 h和10.648 h)；口服給藥方式下，表現(xiàn)出相似特征，在22℃時(shí)氟苯尼考在脊尾白蝦血漿中Cmax(4.87μg/m

7、g)、AUC0~t(47.795 h·mg/L)和F(21.02％)小于28℃水溫(6.99μg/mL、70.288 h·mg/L和28.99%)，且tmax(1 h)、t1/2Kα(0.398 h)、t1/2α(3.623 h)和t1/2β(19.038 h)長(zhǎng)于28℃水溫(0.5 h、0.017 h、1.569 h和11.358 h)。在相同水溫條件，不同給藥方式下，氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的代謝差異也較大：在22℃時(shí)肌注給藥方式下，

8、氟苯尼考在脊尾白蝦血漿中 Cmax(9.44μg/mL)和 AUC0~t(75.779 h·mg/L)大于口服給藥(4.87μg/mg和47.795 h·mg/L)，且t1/2α(1.004 h)和t1/2β(18.26 h)短于口服給藥(3.623 h和19.038 h)；在28℃水溫不同給藥方式下，也表現(xiàn)出相似特征。結(jié)果表明：氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)吸收迅速，分布較廣，但消除緩慢，生物利用度不高。兩種給藥方式下，肌注給藥時(shí)氟苯尼考在脊

9、尾白蝦體內(nèi)的吸收、分布和消除速率均快于口服給藥；不同水溫條件下，28℃時(shí)氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的吸收、分布和消除速率快于22℃條件下，且28℃條件下氟苯尼考的生物利用度也較高。實(shí)際水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中生產(chǎn)中氟苯尼考的使用要考慮到水溫，本實(shí)驗(yàn)建議，28℃水溫時(shí)，脊尾白蝦口服給藥劑量為33.67 mg/(kg·BW)，給藥間隔為9.2 h；22℃水溫時(shí)，脊尾白蝦口服給藥劑量為25.46 mg/(kg·BW)，給藥間隔為10.8 h。
　

10、　2.氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的殘留消除規(guī)律研究
　　在水溫(22±0.4)℃條件下，分別以10、20和40 mg/(kg·BW)氟苯尼考給藥劑量連續(xù)投喂脊尾白蝦5 d，分別于最后一次給藥后的1、2、3、4、5、7、10、15和20 d隨機(jī)挑選脊尾白蝦取血淋巴、肝胰腺、腸、鰓、肌肉和甲殼組織樣品，通過(guò)HPLC法測(cè)定脊尾白蝦各組織中氟苯尼考濃度，研究氟苯尼考在脊尾白蝦各組織中的殘留消除規(guī)律。結(jié)果表明：給藥結(jié)束后第1 d各組織中氟苯尼考

11、的濃度由高到低分別是肝胰腺>腸>血淋巴>肌肉≈鰓>甲殼。同時(shí)氟苯尼考濃度在各個(gè)組織中具有明顯的劑量效應(yīng)，同時(shí)其濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減小。三種給藥劑量下，氟苯尼考在血淋巴中的消除半衰期最短，在腸中消除半衰期最長(zhǎng)，且消除半衰期與給藥劑量無(wú)關(guān)。為滿足食品安全準(zhǔn)則氟苯尼考的最高殘留限量0.1μg/g，本實(shí)驗(yàn)條件下推薦氟苯尼考在脊尾白蝦養(yǎng)殖中的休藥期為7d以上。
　　3.氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的PBPK模型構(gòu)建和參數(shù)優(yōu)化校正
　　假

12、設(shè)氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)以原藥形式存在，在肝胰腺中的清除符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。根據(jù)脊尾白蝦的生理解剖學(xué)參數(shù)和第2部分氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)殘留數(shù)據(jù)結(jié)果，設(shè)計(jì)了包含肝胰腺、肌肉、鰓、甲殼和其他等5大模塊的模型結(jié)構(gòu)，建立了氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)殘留的PBPK模型，對(duì)其進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化校正以及靈敏性分析，比較了模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相關(guān)性和吻合程度；并嘗試將PBPK模型外推至凡納濱對(duì)蝦，用凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)藥殘數(shù)據(jù)

13、驗(yàn)證PBPK模型對(duì)藥物殘留預(yù)測(cè)的有效性。結(jié)果表明：各模塊器官容積和肝胰腺清除率參數(shù)對(duì)模型靈敏性影響最大，PBPK模型擬合的氟苯尼考?xì)埩魸舛阮A(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值吻合較好，能夠準(zhǔn)確反映氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)的殘留消除情況；同時(shí)，PBPK模型外推至凡納濱對(duì)蝦時(shí)，可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)氟苯尼考的殘留情況。說(shuō)明本研究構(gòu)建的氟苯尼考在脊尾白蝦體內(nèi)殘留的PBPK模型預(yù)測(cè)藥物殘留能力具有較高的可信度，這為我國(guó)開(kāi)展甲殼動(dòng)物藥殘預(yù)測(cè)以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供一定的科學(xué)依據(jù)。

14、>　　4.氟苯尼考在感染副溶血弧菌的脊尾白蝦體內(nèi)的藥效學(xué)
　　在水溫(20±0.5)℃條件下，設(shè)立空白對(duì)照組（不攻菌不給藥）、肝損傷對(duì)照組（攻菌不給藥）、氟苯尼考低劑量組(10 mg/(kg·BW))、中劑量組(20 mg/(kg·BW))、高劑量組(40 mg/(kg·BW))。給藥開(kāi)始前，肝損傷對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染1次誘發(fā)肝胰腺損傷，構(gòu)建病理模

15、型，空白對(duì)照組注射同體積PBS無(wú)菌緩沖液。同時(shí)空白對(duì)照組和肝損傷對(duì)照組投喂不含藥物的基礎(chǔ)飼料，低、中和高劑量組分別連續(xù)投喂10 mg/(kg·BW)、20 mg/(kg·BW)和40 mg/(kg·BW)的氟苯尼考藥餌5 d，停藥后觀察一周至12 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄各組發(fā)病情況和死亡率，并于感染后1、3、5和12 d取血淋巴和肝胰腺測(cè)定細(xì)菌數(shù)量的變化情況。于感染后12 h(0.5 d)，感染后連續(xù)給藥5 d以及停藥觀察至12 d從各組隨

16、機(jī)選取10尾脊尾白蝦，對(duì)肝胰腺進(jìn)行外觀形態(tài)觀察和記錄，并分別隨機(jī)取3尾蝦的肝胰腺進(jìn)行病理學(xué)鏡檢。結(jié)果顯示：感染副溶血弧菌5d后，空白對(duì)照組和肝損傷對(duì)照組累計(jì)死亡率分別為0和65.01％，表明疾病模型構(gòu)建成功；而氟苯尼考低劑量組、中劑量組和高劑量組累計(jì)死亡率分別為58%、51%和45.35%，各組之間差異顯著。直至12 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與肝損傷對(duì)照組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組的存活率分別提高了7.01%、14.01%和19.66%，

17、各組之間差異顯著。除空白對(duì)照組外，實(shí)驗(yàn)期間各組血淋巴和肝胰腺中細(xì)菌含量呈下降趨勢(shì)。在第12 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，低劑量組、中劑量組和高劑量組中血淋巴和肝胰腺細(xì)菌含量分別為1.73×102 CFU/ml、0、0和2.81×102 CFU/g、1.13×102 CFU/g、0，與空白對(duì)照組差異不顯著。石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組肝小管細(xì)胞腫脹、空泡比例和破損程度降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氟苯尼考對(duì)副溶血弧菌感染的脊尾白蝦具有良好的防治作用，可用于防治蝦類

18、弧菌性疾病。
　　5.氟苯尼考對(duì)脊尾白蝦免疫-抗氧化酶活性的影響
　　在水溫(20±0.5)℃條件下，設(shè)立對(duì)照組，氟苯尼考組(10 mg/(kg·BW))、中劑量組(20 mg/(kg·BW))、高劑量組(40 mg/(kg·BW))。低、中和高劑量組分別連續(xù)投喂10 mg/(kg·BW)、20 mg/(kg·BW)和40 mg/(kg·BW)的氟苯尼考藥餌5 d，對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料。于停止投喂藥餌后的第3、6、12、24、

19、48、96、168和240 h取血淋巴，測(cè)定HEM含量、ACP、AKP、T-SOD、CAT和T-AOC等指標(biāo)的變化情況。結(jié)果顯示：10 mg/(kg·BW)組和20 mg/(kg·BW)組HEM含量均在3 h時(shí)間點(diǎn)顯著高于對(duì)照組，40 mg/(kg·BW)組在3-48 h時(shí)間點(diǎn)顯著高于對(duì)照組；10 mg/(kg·BW)組和20 mg/(kg·BW)組ACP活性在3和6 h時(shí)間點(diǎn)顯著高于對(duì)照組，40 mg/(kg·BW)組在3-168 h

20、時(shí)間點(diǎn)顯著低于其他三組；10 mg/(kg·BW)組和20 mg/(kg·BW)組AKP活性在3 h時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組，6-48 h時(shí)間點(diǎn)顯著低于對(duì)照組，40 mg/(kg·BW)組在3-48 h時(shí)間點(diǎn)顯著低于對(duì)照組；10 mg/(kg·BW)組和20 mg/(kg·BW)組T-SOD活性整體高于對(duì)照組，分別在6 h和24 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最高值，40 mg/(kg·BW)組在24和48 h時(shí)間點(diǎn)顯著低于對(duì)照組；三劑量組CAT活性均在3

21、和6 h時(shí)間點(diǎn)顯著高于對(duì)照組，之后在12-96 h時(shí)間點(diǎn)顯著低于對(duì)照組，于24 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最低值；三劑量組T-AOC活性均在3-96 h時(shí)間點(diǎn)顯著低于對(duì)照組，于48 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最低值，且出現(xiàn)劑量效應(yīng)。結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)所用氟苯尼考三種劑量對(duì)脊尾白蝦免疫-抗氧化功能具有一定的影響作用。10 mg/(kg·BW)和20 mg/(kg·BW)氟苯尼考對(duì)脊尾白蝦免疫-抗氧化酶活力具有一定誘導(dǎo)作用，而40 mg/(kg·BW)則表現(xiàn)出抑制效應(yīng)。

22、本研究結(jié)果為氟苯尼考在海水養(yǎng)殖實(shí)際生產(chǎn)中使用的安全評(píng)估提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)支持。
　　6.三種不同養(yǎng)殖模式蝦池弧菌對(duì)氟苯尼考耐藥性研究
　　自2016年5月-2016年11月，針對(duì)蝦類三種不同養(yǎng)殖模式地區(qū)：山東日照海辰水產(chǎn)有限公司魚蝦蟹貝混養(yǎng)養(yǎng)殖池塘、山東濰坊新大地水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖池和山東青島卓越海洋集團(tuán)有限公司工廠化換水養(yǎng)殖池的水樣進(jìn)行弧菌的分離純化培養(yǎng)、鑒定及保存；以藥敏紙片法和微量肉湯稀釋法對(duì)收集的弧菌進(jìn)行

23、了氟苯尼考的耐藥性檢測(cè)；檢測(cè)了氟苯尼考耐藥相關(guān)基因（floR和 cfr基因）和整合子-基因盒的攜帶情況。結(jié)果顯示：從日照、濰坊和青島三地共分離到20種142株弧菌，其中日照地區(qū)分離出18種69株、濰坊地區(qū)分離出9種56株，青島地區(qū)分離出4種17株。其中以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)菌株最多，分別為37株和31株，共占分離株總數(shù)的47.89%。藥敏紙片法和微量肉湯稀釋法檢測(cè)

24、共分離出耐藥菌株21株，耐藥率為14.79％。日照對(duì)氟苯尼考耐藥菌株有7株，耐藥率為10.14％；濰坊對(duì)氟苯尼考耐藥菌株有13株，耐藥率為23.21％；青島對(duì)氟苯尼考耐藥菌株有1株，耐藥率5.88％。通過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)鑒定的142株弧菌中floR基因陽(yáng)性菌株共有27株，陽(yáng)性率為19.01％，其中日照有10株，濰坊15株，青島2株；142株弧菌均未檢測(cè)到cfr基因。在表型耐藥的21株耐氟苯尼考菌株中有6株含有完整的整合子的保守區(qū)，檢出率為2

25、8.57%，其中菌株R-3（燦爛弧菌Vibrio splendidus）和R-5（嗜環(huán)弧菌Vibrio cyclitrophicus）的int1可變區(qū)還攜帶有基因盒，均為arr-3-dfrA27基因盒，陽(yáng)性率為9.52%。此外，菌株R-17（溶藻弧菌）可檢測(cè)到 ISCR元件可變區(qū)攜帶的dhfr耐藥基因盒。結(jié)果表明，這三種養(yǎng)殖模式中，魚蝦蟹貝混養(yǎng)池塘養(yǎng)殖模式含有的弧菌種類和數(shù)量最多，工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖模式次之，工廠化換水養(yǎng)殖模式最少；而工廠