hpRNA和pac1基因介導(dǎo)抗大麥黃矮病毒轉(zhuǎn)基因小麥研究.pdf

1、本文從進(jìn)一步提高對(duì)BYDV的特異抗性和病毒廣譜抗性兩個(gè)方面入手進(jìn)行小麥轉(zhuǎn)基因研究，希望獲得高抗BYDV的轉(zhuǎn)基因小麥植株和具有廣譜病毒抗性的轉(zhuǎn)基因小麥。 在提高對(duì)BYDV抗性的轉(zhuǎn)基因小麥研究方面，利用BYDV-GPV株系的復(fù)制酶基因(Rep)片段和外殼蛋白基因(CP)片段構(gòu)建成可表達(dá)復(fù)合發(fā)夾RNA(hpRNA)——含有由Rep片段雙鏈(CP雙鏈)RNA構(gòu)成的莖和反義CP(反義復(fù)制酶片斷)RNA構(gòu)成的環(huán)——的表達(dá)框架，將該框架分別連

2、入含有CaMV35S啟動(dòng)子和Emu啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(轉(zhuǎn)35S：CP+/Rep-/CP-結(jié)構(gòu))、基因槍法(轉(zhuǎn)Emu：Rep+/CP-/Rep-結(jié)構(gòu))和花粉管通道法(分別轉(zhuǎn)Emu：Rep+/CP-/Rep-和Emu：CP+/Rep-/CP-結(jié)構(gòu))對(duì)小麥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，基于該結(jié)構(gòu)表達(dá)的hpRNA誘發(fā)植物體內(nèi)針對(duì)病毒基因組不同部位的RNA干擾機(jī)制而達(dá)到特異性高度抗病毒的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：①在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的82株G418

3、抗性植株中有75株P(guān)CR結(jié)果呈陽性；經(jīng)過第一次病毒抗性試驗(yàn)，有59株未發(fā)病或只有輕微癥狀；Dotblot檢測(cè)表明59株抗性植株中有46株整合有外源基因；ELISA結(jié)果表明整合有外源基因的植株中有37株能夠正常表達(dá)外源基因；Southernblot結(jié)果表明外源基因在小麥體內(nèi)多以雙拷貝形式存在；第二次病毒抗性試驗(yàn)表明，在Dotblot、ELISA呈陽性的37株再生植株中有14株表現(xiàn)低度抗性，有12株表現(xiàn)中度抗性，有10株表現(xiàn)高度抗性，另外1

4、株在實(shí)驗(yàn)過程中死亡。②在基因槍法轉(zhuǎn)化中，因未使用標(biāo)記基因，故應(yīng)用改進(jìn)的葉片快速PCR對(duì)再生幼苗在生根階段進(jìn)行篩選，共移栽成活64株快速PCR陽性植株；經(jīng)第一次病毒抗性試驗(yàn)有30株表現(xiàn)抗性，Dotblot結(jié)果表明其中21株整合有外源基因；經(jīng)第二次病毒抗性試驗(yàn)，21株Dotblot陽性植株中有5株表現(xiàn)低度抗性，有8株表現(xiàn)中度抗性，有8株表現(xiàn)高度抗性。③通過花粉管通道法獲得轉(zhuǎn)Emu：Rep+/CP-/Rep-結(jié)構(gòu)的種子367粒，獲得轉(zhuǎn)Emu：

5、CP+/Rep-/CP-結(jié)構(gòu)的種子545粒；對(duì)T1代幼苗進(jìn)行大田抗病性鑒定結(jié)果表明，有2株轉(zhuǎn)Emu：CP+/Rep-/CP-結(jié)構(gòu)小麥植株在接毒40天后仍沒有明顯發(fā)病癥狀。 在提高病毒抗性譜方面，利用克隆自粟酒酵母的pac1基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥。該基因是一種RNA雙鏈分解酶。由于大多數(shù)植物病毒為RNA病毒，不管其基因組是單鏈還是雙鏈，在寄主體內(nèi)復(fù)制過程都會(huì)有一個(gè)雙鏈RNA中間體階段，如果通過基因工程手段將pac1基因轉(zhuǎn)入植

6、物體，利用其降解病毒dsRNA的活性而阻斷病毒復(fù)制過程，就有可能達(dá)到抗植物病毒病的目的。并且pac1的作用靶位點(diǎn)只針對(duì)RNA雙鏈，對(duì)RNA的序列無特殊要求，這就擴(kuò)大了其對(duì)病毒抗性譜。本轉(zhuǎn)化試驗(yàn)共獲得41株G418抗性植株；經(jīng)第一次病毒抗性試驗(yàn)獲得30株抗性植株；其中27株P(guān)CR和Dotblot結(jié)果呈陽性；ELISA和RT-PCR結(jié)果表明27株整合有外源基因的再生植株中有25株能夠正常表達(dá)外源基因；經(jīng)第二次病毒抗性試驗(yàn)，獲得12株低度抗性

7、植株，12株中度抗性植株，1株高度抗性植株。對(duì)于轉(zhuǎn)pac1基因小麥能否對(duì)其他小麥病毒表現(xiàn)抗性、真正達(dá)到廣譜抗病毒的目的，我們將在后續(xù)的工作中做進(jìn)一步研究。 最后，針對(duì)構(gòu)建hpRNA時(shí)需要多次連接反應(yīng)的問題，設(shè)計(jì)了一個(gè)含有新型表達(dá)框架的雙元載體，只要通過1步連接反應(yīng)既可構(gòu)建完成可表達(dá)目的基因dsRNA的真核表達(dá)載體。以轉(zhuǎn)有綠色熒光蛋白的煙草中的GFP為沉默目的基因，通過農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)成功地沉默了煙草中的GFP，這就證實(shí)了該載體