低分子柑橘果膠抑制Galectin--3誘導(dǎo)的MDSC細(xì)胞增敏乳腺癌化療.pdf

1、研究背景:
　　2013年末Science評(píng)出年度十大科學(xué)進(jìn)展，腫瘤免疫療法奪魁[1]，腫瘤免疫細(xì)胞治療技術(shù)已逐漸成為繼手術(shù)、放療、化療之后的第四類治療手段而日益受到重視。2011年Weinberg等在Cell發(fā)表了重要綜述，總結(jié)癌癥的十大特征，免疫逃逸被概括為其典型生物學(xué)特性[2]。同年，諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予Ralph Steinman等三位免疫學(xué)家，自此，抗腫瘤監(jiān)視逃脫機(jī)制和抗腫瘤免疫治療取得了日新月異的突破[3]。曹雪濤院士在N

2、atureImmunology綜述了腫瘤發(fā)生過(guò)程中的免疫正性調(diào)節(jié)和負(fù)性調(diào)節(jié)“陰陽(yáng)失衡”觀點(diǎn)[4]，分析了免疫抑制細(xì)胞增多是自身免疫系統(tǒng)抗腫瘤失敗的關(guān)鍵因素。
　　髓系來(lái)源免疫抑制細(xì)胞(Myeloid derived suppressor cell，MDSC)最早發(fā)現(xiàn)于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中[5，6]，隨著研究深入，MDSC被發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者的外周血、腫瘤局部、引流淋巴結(jié)、脾臟、骨髓等免疫器官均有分布，且與不良預(yù)后相關(guān)[7]。其免疫抑制功

3、能是通過(guò)iNOS和精氨酸酶Arginase-1及下游效應(yīng)分子NO或ROS，擴(kuò)增免疫抑制性的CD4+CD25+FoxP3+ Treg細(xì)胞、削弱效應(yīng)性T細(xì)胞激活，在更高層面上進(jìn)行免疫負(fù)性調(diào)節(jié)[8]。MDSC還與免疫抑制性的M2腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞(TAM)通過(guò)TGFβ和IL-10進(jìn)行交互作用，增強(qiáng)抑制性的免疫微環(huán)境[9]。又有文獻(xiàn)表明，腫瘤通過(guò)外泌體(exosomes)調(diào)節(jié)IL6-STAT3通路和TLR2通路，也能激活MDSC擴(kuò)增、增強(qiáng)免疫抑制

4、，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[10]。因此，腫瘤-MDSC-Treg調(diào)控軸在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視。
　　腫瘤化療是目前最有效的全身治療手段，強(qiáng)烈化療雖能通過(guò)急性炎癥、凋亡誘導(dǎo)等途徑，促進(jìn)腫瘤相關(guān)抗原釋放而增強(qiáng)腫瘤免疫原性、提升機(jī)體抗腫瘤免疫[11,12]，但其免疫負(fù)性調(diào)節(jié)作用也很明顯——Nature Medicine報(bào)道，吉西他濱和5-FU等藥物，能上調(diào)MDSC細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)腫瘤免疫抑制性而削弱療效[13]。目前一類靶向清除免疫抑制細(xì)胞

5、的單抗藥物已獲得成功，比如特異性抑制負(fù)調(diào)控分子CTLA-4（伊匹單抗，Ipilimumab）和PD-1/PD-L1(BMS-936558)的新藥，已經(jīng)在惡性黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌中取得明顯療效[14,15]。這說(shuō)明靶向清除免疫抑制性細(xì)胞(Treg、MDSC細(xì)胞等)，解除腫瘤免疫耐受狀態(tài)，調(diào)動(dòng)人體自身免疫殺傷功能，能夠取得較好的治療效果。
　　Galectin-3（半乳糖凝集素-3）發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)90年代，屬凝集素家族，廣泛表達(dá)于上皮

6、細(xì)胞和免疫細(xì)胞，參與多種生物學(xué)功能，如生長(zhǎng)、粘附、凋亡等[16,17]。近年文獻(xiàn)報(bào)道，在多種腫瘤中Gal-3表達(dá)均升高[18]，進(jìn)一步上調(diào)Arginase-1等抑制性基因，調(diào)控腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞(TAM)向免疫抑制性的M2細(xì)胞分化，能削弱抗腫瘤免疫，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[19]。本課題組長(zhǎng)期從事腫瘤微環(huán)境免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究，項(xiàng)目負(fù)責(zé)人于2007-2009年在美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與基因治療研究中心進(jìn)修，跟隨Wang Rongfu教授的Peng Weiy

7、i小組學(xué)習(xí)，該小組發(fā)現(xiàn)Gal-3作為結(jié)腸癌腫瘤抗原，可激活腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞，但在高濃度時(shí)卻誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[20]。有研究表明此種誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，在于外源性Gal-3結(jié)合T細(xì)胞表面CD29/CD7復(fù)合物，激活凋亡通路[21]。
　　研究目的:
　　本項(xiàng)目主要目標(biāo)在于闡明Gal-3分子的天然配體LCP通過(guò)拮抗Gal-3信號(hào)通路，下調(diào)荷瘤小鼠體內(nèi)MDSC細(xì)胞的數(shù)目、解除其免疫抑制效應(yīng)、協(xié)同化療增效的確切分子機(jī)制。隨著本項(xiàng)目在腫瘤免

8、疫學(xué)基礎(chǔ)研究、轉(zhuǎn)化研究的突破，對(duì)未來(lái)進(jìn)行臨床試驗(yàn)驗(yàn)證LCP逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制，并聯(lián)合T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療及傳統(tǒng)放化療的綜合治療模式也是有益提示，故本項(xiàng)目不僅有理論價(jià)值，在臨床應(yīng)用方面具有廣闊前景。
　　研究?jī)?nèi)容:
　　1、明確抗腫瘤化療模型中LCP處理與MDSC水平的確切關(guān)系:繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線分析LCP對(duì)化療增敏作用;提取LCP處理小鼠的血清，經(jīng)HPLC-MS法分析小鼠血清中LCP的有效含量，及LCP有效成分的低分子糖蛋白序列、

9、結(jié)構(gòu);流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析MDSC細(xì)胞的在不同處理組中的比例差異。
　　2、Gal-3信號(hào)通路阻斷對(duì)MDSC細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用:RNA水平及蛋白水平分析4T1腫瘤細(xì)胞和小鼠MDSC細(xì)胞Gal-3基因表達(dá)水平;使用Gal-3抗體或化學(xué)合成Gal-3，正向、負(fù)向調(diào)節(jié)Gal-3信號(hào)通路，明確Gal-3在血漿中的免疫調(diào)節(jié)作用;以及Gal-3在MDSC細(xì)胞中的存活、增殖、分化等多個(gè)環(huán)節(jié)中的調(diào)節(jié)作用。
　　3、Gal-3對(duì)MDSC分

10、化、成熟、行使功能過(guò)程中基因表達(dá)的調(diào)控:使用Gal-3基因敲除小鼠，分析Gal-3下游信號(hào)通路的相關(guān)靶分子，如K-ras、 PI3K等，在MDSC免疫調(diào)節(jié)作用中，RNA水平和蛋白質(zhì)水平的變化。
　　結(jié)論與創(chuàng)新:
　　1、利用4T1細(xì)胞系建立了Balb/c小鼠的乳腺癌自發(fā)腫瘤模型，并利用該模型闡明低分子柑橘果膠聯(lián)合化療可抑制乳腺癌的腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)乳腺癌荷瘤小鼠的生存時(shí)間。
　　2、低分子柑橘果膠協(xié)同化療增敏的機(jī)制，不是通