LKB1與TGFβ-smad信號(hào)分子在Peutz-Jeghers綜合征的表達(dá)研究.pdf

1、背景
　　 Peutz-Jeghers綜合征(PJS)是一種以皮膚粘膜黑斑、胃腸道多發(fā)息肉為特征的常染色體顯性遺傳病。PJS診斷標(biāo)準(zhǔn):胃腸道多發(fā)性錯(cuò)構(gòu)瘤息肉是基本診斷,伴有皮膚粘膜黑斑色素沉著或PJS家族史或直接測(cè)序LKB1突變?yōu)榕R床診斷特征[1]。其臨床發(fā)病率在1/120000-1/8300[2]之間。PJS患者發(fā)生消化道腫瘤或伴胃腸道外器官(胰腺、卵巢、睪丸、乳腺和子宮等)腫瘤風(fēng)險(xiǎn)是普通人群的15.2倍[3]。據(jù)報(bào)道30-8

2、0％的PJS患者伴有LKB1/STK11(serine threonine kinase 11)基因的胚系突變,該基因?yàn)楸静〉闹饕虏』?其突變?cè)斐傻慕囟痰鞍椎葻o(wú)功能蛋白的形成,影響生物學(xué)活性及功能[4]。LKB1一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶,其與細(xì)胞極化、能量代謝、抑癌作用等有關(guān)。無(wú)論散發(fā)或家族性PJS患者,其消化道息肉最終轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)腸腺癌,是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程。有人認(rèn)為有兩種機(jī)理導(dǎo)致PJS患者惡變,即錯(cuò)鉤瘤→腺瘤→腺癌途徑和de nove的

3、惡變途徑[5]。從病理角度分析,錯(cuò)構(gòu)瘤組織出現(xiàn)間質(zhì)增生,上皮細(xì)胞形態(tài)正常但排列紊亂。結(jié)腸腺瘤組織出現(xiàn)細(xì)胞異型性,排列紊亂。兩者均不突破基底膜。腫瘤的發(fā)生除了抑癌基因失活、原癌基因激活,其細(xì)胞微環(huán)境也對(duì)腫瘤形成起作用[6]。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFp是由多種細(xì)胞分泌的蛋白,參與調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤惡變、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的多個(gè)重要環(huán)節(jié)[7]。TGFβ/Smad信號(hào)通路是TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)的主要途徑。TGFβ進(jìn)入細(xì)胞與受體結(jié)合后,磷酸化

4、激活Smad蛋白,進(jìn)入細(xì)胞核,發(fā)揮各種轉(zhuǎn)錄因子作用[8]。TGFβl是細(xì)胞和組織中最豐富的TGFβ成員。磷酸化Smad2分子(pSmad2)是TGFβ/Smad信號(hào)通路激活的重要分子[9]。大量研究顯示TGFβl對(duì)于不同類型細(xì)胞有不同效應(yīng)[10]對(duì)于間充質(zhì)細(xì)胞,它的主要作用是促進(jìn)其增殖；而對(duì)于上皮細(xì)胞,通過(guò)生長(zhǎng)抑制作用控制上皮細(xì)胞增殖[11]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGFβ1“激活”上皮細(xì)胞周圍基質(zhì),使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,這提示TGF

5、β1對(duì)具有促癌作用的基質(zhì)環(huán)境的形成起著關(guān)鍵作用[12]。Vaahtomed,K研究表明敲除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的LKB1基因,其TGFβ1水平降低,依賴TGFβ1/Smad信號(hào)的轉(zhuǎn)錄水平降低,不能刺激成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞[13]；TGFβ1通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá),刺激血管形成,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移；而Londesborough,A研究證實(shí)敲除了小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的LKB1基因,TGFβ1信號(hào)通路水平激活減弱,介導(dǎo)的血管

6、平滑肌細(xì)胞的募集作用障礙。說(shuō)明TGFβ1介導(dǎo)血管形成的作用需要內(nèi)皮細(xì)胞中LKB1基因參與[14]。
　　 2008年P(guān)ekka Katajisto等對(duì)條件性敲除LKB1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明其胃腸道平滑肌細(xì)胞特異性LKB1信號(hào)缺失導(dǎo)致胃腸道間質(zhì)細(xì)胞分泌的TGFβ1蛋白減少,不能維持上皮正常增殖,出現(xiàn)了與人PJS腸道病理特征相同的腸道錯(cuò)構(gòu)瘤。說(shuō)明提示PJS腫瘤形成與間質(zhì)作用有密切關(guān)系[15]。在PJS錯(cuò)構(gòu)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,LK

7、B1與TGFβl/Smad信號(hào)通路的相互關(guān)系可能發(fā)揮了重要作用。
　　 研究目的：
　　 1、通過(guò)對(duì)PJS錯(cuò)構(gòu)瘤中LKBl、TGFβ1、Smad2在mRNA及蛋白水平上的表達(dá)及相關(guān)性分析,探討LKB1與TGFβ/Smad信號(hào)分子的關(guān)系,及在PJS錯(cuò)構(gòu)瘤形成中可能的作用。另外在mRNA及蛋白水平對(duì)正常粘膜、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸腺癌中LKB1、TGFβ1、Smad2表達(dá)進(jìn)行分析,明確各種病理組織中,各分子表達(dá)的程度及是否存在相互關(guān)

8、系；探討LKB1、TGFβ1/Smad信號(hào)中分子表達(dá)程度變化趨勢(shì)能提示錯(cuò)構(gòu)瘤-結(jié)腸腺瘤-結(jié)腸腺癌的演變。
　　 2、探討血清TGFβl含量在正常人及PJS患者、結(jié)腸腺瘤患者、結(jié)腸腺癌患者人群中的差異。
　　 材料與方法
　　 1.LKB1、TGFβ1、Smad2 mRNA檢測(cè):5例正常腸粘膜、10例PJS錯(cuò)構(gòu)瘤、10例結(jié)腸腺瘤及10例結(jié)腸腺癌,提取新鮮組織中RNA,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄(RT)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)L

9、KBl、TGFβl、Smad2 mRNA表達(dá)水平。
　　 2.LKB1、TGFβ1、pSmad2蛋白檢測(cè):20例正常腸粘膜組織,20例PJS息肉、20例結(jié)腸腺瘤及28例結(jié)腸腺癌石蠟標(biāo)本,通過(guò)免疫組織化學(xué)分析LKB1、TGFβ1、pSmad2蛋白的表達(dá)部位及程度。
　　 3、ELASA法血清學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)TGFβ1蛋白的表達(dá):采用ELASA方法檢測(cè)TGFβ1分別在10例正常人、10例PJS病人、10例結(jié)腸腺瘤及10例結(jié)腸腺癌患

10、者血清中的表達(dá)。
　　 4、統(tǒng)計(jì)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩獨(dú)立樣本差異比較采用Mannn-Whitney U檢驗(yàn)；多組獨(dú)立樣本比較采用One-Way ANOVA,如果資料不屬于正態(tài)分布或方差不齊及多組等級(jí)資料秩和檢驗(yàn)采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；三個(gè)變量中任意兩雙變量相關(guān)性分析采用偏相關(guān)分析。以雙側(cè)a=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn),檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05為有顯著性差異或有顯著相關(guān)關(guān)系,r偏相關(guān)系數(shù)表示

11、三者中兩者之間的偏相關(guān)關(guān)系密切程度。
　　 結(jié)論
　　 1、與正常腸粘膜組織相比,PJS錯(cuò)構(gòu)瘤組織中LKB1在RNA及蛋白水平上的降低,同時(shí)TGFβ1、pSmad2在蛋白水平上有同樣趨勢(shì)的改變。免疫組化顯示蛋白水平LKB1與TGFβ1,TGFβ1與pSmad2有顯著正相關(guān)。提示PJS組織中LKB1影響間質(zhì)TGFβ1的產(chǎn)生,兩者存在相關(guān)關(guān)系。推測(cè)LKB1及TGFβ1/Smad信號(hào)通路改變可能是PJS錯(cuò)構(gòu)瘤發(fā)生的因?yàn)橹弧?

12、br>　　 2、LKB1蛋白在正常腸粘膜、PJS錯(cuò)構(gòu)瘤、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸腺癌組織中無(wú)顯著性差異。LKB1基因廣泛存在于正常腸粘膜細(xì)胞胞質(zhì)中,在增殖性細(xì)胞中有不同程度的降低。
　　 3、TGFβ1蛋白在各個(gè)組織中表達(dá)有顯著性差異。表達(dá)趨勢(shì)由強(qiáng)到弱依次為結(jié)腸腺癌組,正常粘膜組、結(jié)腸腺瘤組、PJS組。推測(cè)LKB1基因的改變影響了TGFβ1蛋白的表達(dá)。
　　 4、pSmad2蛋白在各個(gè)組織中表達(dá)有顯著性差異。表達(dá)趨勢(shì)由強(qiáng)到弱依次

13、為結(jié)腸腺瘤組,正常粘膜組、PJS組、結(jié)腸腺癌組,在結(jié)腸腺癌中表達(dá)量大大減低可能由于TGFβⅡ類受體突變引起的胞外大量TGFp1蛋白無(wú)法激活胞內(nèi)的Smad2蛋白,pSmad2蛋白量減少,TGFβ/Smad信號(hào)通路功能減弱。而在結(jié)腸腺瘤中,其TGFβ1信號(hào)正常激活細(xì)胞內(nèi)的pSmad2,維持了腺瘤上皮的生長(zhǎng)。
　　 5、在人血清中分泌蛋白的量與組織中的量強(qiáng)度趨勢(shì)一致,表明血清中TGFβ1可以作為腸道病變的一個(gè)標(biāo)志物,惡變組織表達(dá)高于正