NO生成合劑對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用.pdf

1、目的：
　　 糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是多病因引起的慢性代謝性疾病。皮膚病變?nèi)鐫儭木?、局部感染等是糖尿病患者極為常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)之一。創(chuàng)傷難愈并發(fā)癥的出現(xiàn)與糖尿病患者皮膚組織的創(chuàng)傷愈合能力低下有直接關(guān)系。如何更快的促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù),局部用藥是一種重要的輔助治療,而目前方法很多,但療效往往不令人滿意。本實(shí)驗(yàn)主要是利用NO在創(chuàng)面愈合中的重要作用,同時(shí)改變創(chuàng)面的微環(huán)境,為創(chuàng)面的愈合提供一種新的局部用藥治療方法:

2、由促一氧化氮生成的L-精氨酸、硝普鈉和超氧陰離子生成抑制劑夾竹桃麻素形成合劑,對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面的進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用,明確其方法在創(chuàng)面愈合中的作用。通過(guò)建立STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病小鼠模型和創(chuàng)傷難愈模型,給予促NO合劑進(jìn)行干預(yù)創(chuàng)面愈合過(guò)程,觀察外源性藥物在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中對(duì)傷口愈合時(shí)間、肉芽組織生長(zhǎng)及表皮細(xì)胞增殖的影響;應(yīng)用免疫組化方法,揭示創(chuàng)面愈合時(shí)TGF-β1因子的表達(dá)規(guī)律和血管生成情況;通過(guò)光鏡觀察創(chuàng)面不同時(shí)間點(diǎn)的成纖維細(xì)胞數(shù)量及膠原纖維含量

3、;研究NO合劑對(duì)創(chuàng)面愈合的影響,并探討其機(jī)制,為臨床上在治療糖尿病難愈創(chuàng)面時(shí)提供理論依據(jù)。
　　 方法
　　 1.模型建立
　　 1.1建立STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病小鼠模型
　　 小鼠標(biāo)記稱重后,連續(xù)4d腹腔注射STZ(50mg/kg),小鼠禁食不禁水10h,由尾靜脈取血,連續(xù)8周跟蹤檢測(cè)小鼠的血糖濃度及體重變化。
　　 1.2建立STZ糖尿病小鼠創(chuàng)傷難愈模型
　　 空腹血糖濃度高于11.1

4、 mmol/L,且連續(xù)出現(xiàn)多飲、多食、多尿者選為糖尿病模型小鼠。將小鼠以10％水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射麻醉后,在背部中線兩側(cè)(間距1cm以上),以直徑1cm打孔器打孔、止血,單籠喂養(yǎng)。跟蹤檢測(cè)其創(chuàng)口愈合速度直至完全愈合。
　　 2.NO合劑對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合作用的觀察
　　 實(shí)驗(yàn)分組:共設(shè)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組,即糖尿病小鼠對(duì)照組、糖尿病小鼠L-精氨酸(L-Arg)治療組(A組)、糖尿病小鼠夾竹桃麻素(APO)治療組、糖尿病小

5、鼠硝普鈉(SNP)治療組、糖尿病小鼠NO合劑治療組,每組10只小鼠。給藥方法:小鼠背部創(chuàng)面建立成功后,按照不同組別,分別以生理鹽水、L-arg溶液(150g/L,去離子水配制)、APO溶液(1×10-4mol/L,去離子水配制)、SNP溶液(0.1mmol/L,去離子水配制)及NO合劑(L-arg、APO、SNP溶液等比混合,臨用前配制)在相應(yīng)組小鼠創(chuàng)面用無(wú)菌注射器皮下注射各0.15ml,隔天一次。標(biāo)本采集:在治療后的第1、3、5、7、

6、10天,應(yīng)用數(shù)碼照相機(jī)拍下創(chuàng)面情況,記錄愈合的面積。于傷后第3、7、10天分別取創(chuàng)緣組織,10％福爾馬林固定,石蠟包埋連續(xù)性切片后,常規(guī)HE、VG染色,觀察創(chuàng)面成纖維細(xì)胞、血管新生及膠原沉積等情況,評(píng)價(jià)創(chuàng)面愈合效果。
　　 2.1計(jì)算創(chuàng)面愈合率使用透明方格紙描繪創(chuàng)口,用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件計(jì)算面積,并按以下公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率:創(chuàng)面愈合率=(創(chuàng)面初始面積-創(chuàng)面形成后第n天的面積)/創(chuàng)面初始面積×100％。
　　 2.2成纖維

7、細(xì)胞密度測(cè)定400倍光鏡下觀察HE染色切片,分別在組織中央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取10個(gè)矩形視野(0.0052 mm2/視野),目測(cè)計(jì)數(shù)并計(jì)算切片內(nèi)單位面積成纖維細(xì)胞數(shù)量。
　　 2.3.膠原纖維面密度測(cè)定400倍光鏡下觀察VG染色組織切片,分別在組織中央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取5個(gè)視野,利用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)計(jì)算紅染的膠原纖維的面密度。
　　 3.NO合劑對(duì)小鼠創(chuàng)面血管生成

8、和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的研究
　　 3.1血管密度的測(cè)定以抗血管Ⅷ因子抗體對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。參照weidne的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn):呈現(xiàn)棕色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為1個(gè)血管計(jì)數(shù),肌層較厚及管腔面積大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管均不計(jì)數(shù)。400倍光鏡下在每張切片的中央?yún)^(qū)、周邊區(qū)各隨機(jī)選取5個(gè)血管密集的視野,取其平均數(shù)作為該標(biāo)本的平均血管密度(MVD)。
　　 3.2轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子測(cè)定以TGF-β1抗體對(duì)

9、標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。觀察指標(biāo)用光學(xué)顯微鏡(10×40倍)觀察TGF-β1免疫陽(yáng)性纖維的分布用Mplas-500多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng),通過(guò)顯微攝像系統(tǒng)放大400倍,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,在該視野中選定TGF-β1(+)標(biāo)準(zhǔn),以圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)測(cè)量出結(jié)果,單位μm2。
　　 采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有計(jì)量數(shù)據(jù)以(x-±s)表示,進(jìn)行t檢驗(yàn),p＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

10、。
　　 結(jié)果
　　 1.連續(xù)8周跟蹤檢測(cè)小鼠的血糖濃度及體重變化;檢測(cè)結(jié)果表明小鼠血糖濃度顯著增高(p＜0.05),而體重明顯下降(p＜0.05),且體征持續(xù)8周以上,與文獻(xiàn)報(bào)道的STZ糖尿病小鼠模型一致;表明STZ在小鼠體內(nèi)成功誘導(dǎo)Ⅰ型糖尿病。
　　 2.STZ糖尿病小鼠創(chuàng)口的整個(gè)愈合過(guò)程比對(duì)照組明顯滯后(p＜0.05),說(shuō)明手術(shù)使STZ糖尿病小鼠出現(xiàn)了創(chuàng)傷難愈現(xiàn)象,也說(shuō)明糖尿病嚴(yán)重?fù)p傷了小鼠皮膚組織的創(chuàng)傷愈

11、合能力。
　　 3.對(duì)照組于創(chuàng)傷后16-18天可以基本愈合;NO合劑治療組肉芽組織生長(zhǎng)好,愈合時(shí)間較對(duì)照組提前3-4天。其他單劑治療組愈合情況良好,較對(duì)照組提前1-2天,創(chuàng)面形成后第3天起,各藥物治療組小鼠創(chuàng)面愈合率較對(duì)照組明顯上升,以創(chuàng)面形成后7d內(nèi)變化最為明顯。
　　 4.各實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)傷后3天可見(jiàn)細(xì)胞增生、膠原形成,7-10天成纖維細(xì)胞增生明顯,膠原纖維排列整齊;實(shí)驗(yàn)組在創(chuàng)傷后3、7天成纖維細(xì)胞數(shù)密度(NA)均高于對(duì)照

12、組水平,而在創(chuàng)傷后10天均低于對(duì)照組;其中,NO合劑治療組較各藥物單劑治療組差異更為明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組膠原纖維面密度(AA)均呈持續(xù)性增加的趨勢(shì),實(shí)驗(yàn)組在所有時(shí)間點(diǎn)AA均高于對(duì)照組(P＜0.05),單劑各組比較差異不明顯
　　 5.TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞比率:NO合劑治療組用藥后3天細(xì)胞陽(yáng)性染色明顯,3-7天細(xì)胞中的TGF-β1在細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)并達(dá)到高峰,創(chuàng)傷后7-14天細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱至相對(duì)

13、維持穩(wěn)定水平。實(shí)驗(yàn)組在3、7天時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性表達(dá)均高于對(duì)照組(P＜0.01),對(duì)照組細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)峰值明顯滯后,且表達(dá)量少于其他組:而與其它單劑干預(yù)組組間比較差異不明顯。
　　 6.NO合劑治療組在創(chuàng)傷后3-7天內(nèi)皮細(xì)胞增生活躍,較對(duì)照組有更多的毛細(xì)血管形成(P＜0.01),與其他單劑干預(yù)組比較,血管生成的數(shù)量亦有差異(P＜0.05)。對(duì)照組血管生成明顯較少,且炎性反應(yīng)較其他組嚴(yán)重。其中NO合劑治療組與對(duì)照組的差異最為顯著(P＜