人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化成神經(jīng)干細(xì)胞及其移植治療腦出血的研究.pdf

1、背景:腦出血(intracerebralhemorrhage,1CH)是指原發(fā)性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)。目前臨床上仍無有效的治療方法用于改善幸存者的神經(jīng)功能缺陷。實(shí)驗(yàn)證明神經(jīng)干細(xì)胞移植能夠促進(jìn)腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。目前，神經(jīng)干細(xì)胞主要從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)或是直接從發(fā)育中和成年哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離培養(yǎng)獲得。但是倫理學(xué)、安全性問題以及細(xì)胞來源和數(shù)量的有限，在一定程度上都限制了神經(jīng)干細(xì)胞的移植

2、應(yīng)用。因此，很有必要尋找其它能夠獲得神經(jīng)干細(xì)胞的途徑來克服這些限制。研究發(fā)現(xiàn)采用堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)和表皮細(xì)胞生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)可直接誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSC)向神經(jīng)干細(xì)胞(nerualstemcell,NSC)轉(zhuǎn)化。最近，臍帶(Umbilicalcord,U

3、C)被發(fā)現(xiàn)可以作為間充質(zhì)干細(xì)胞的理想來源，因此臍帶MSC(UC-MSC)是否可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞以及獲得的神經(jīng)干細(xì)胞能否促進(jìn)腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)，很值得我們?nèi)パ芯俊?br>　　 目的:探討體外誘導(dǎo)人UC-MSC向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可行性;建立大鼠腦出血模型，探討獲得的神經(jīng)干細(xì)胞移植后在大鼠腦內(nèi)的存活、分布和分化情況以及對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，為人UC-MSC在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:取足月

4、妊娠剖宮產(chǎn)的新生兒臍帶，利用酶消化法和貼壁法獲得原代細(xì)胞，傳4-6代后備用。在添加了bFGF,FGFB,SHH和LIF的DMEM/DF-12完全培養(yǎng)基中預(yù)誘導(dǎo)UC-MSC6-8天，然后消化重新接種在添加了bFGF,FGFB,SHH和2％N2/B27的neurobasalmedia中，定向誘導(dǎo)大約20天后獲得神經(jīng)干細(xì)胞(NSCderivedfromUC-MSC,UC-NSC)。一方面，通過real-timeRT-PCR和免疫熒光染色分別檢

5、測(cè)mRNA和蛋白水平上Nestin,NeuroDl.Tubulin,GFAP,Galc以及Fibronectin的表達(dá)情況。另外，體外誘導(dǎo)UC-NSC向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，進(jìn)一步鑒定其是否具有神經(jīng)干細(xì)胞的特點(diǎn)。另一方面，通過流式細(xì)胞學(xué)以及成骨和成脂能力來檢測(cè)UC-NSC的細(xì)胞免疫表型以及向中胚層分化的能力，鑒定其是否喪失了UC-MSC的特性。此外，為了進(jìn)一步研究UC-NSC的治療潛能，我們將其移植至大鼠腦出血模型中，觀察其對(duì)神經(jīng)功

6、能恢復(fù)的影響。建模后24小時(shí)，將CM-Dil標(biāo)記的UC-MSC和UC-NSC移植至血腫周圍。在移植后的7周每周都采用mNSS和MLPT兩種方法進(jìn)行一次神經(jīng)功能評(píng)價(jià)。于移植后3天，通過“干濕重法”進(jìn)行腦水容量分析。于移植后3天和7天，通過免疫組化染色觀察IL-1β在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)情況;在移植后35天，制備腦冰凍切片，觀察移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活、分布和分化情況。此外，通過免疫熒光染色GFAP分析損傷區(qū)周圍膠質(zhì)細(xì)胞增殖情況，并測(cè)量了膠質(zhì)癱痕的厚

7、度。同時(shí)，我們還進(jìn)行結(jié)晶紫/速蘭染色顯示其損傷區(qū)域，檢測(cè)了各組腦出血損傷體積的變化。
　　 結(jié)果:人UC-MSC在體外可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為UC-NSC，并且獲得的UC-NSC不僅具有神經(jīng)干細(xì)胞的特點(diǎn)，同時(shí)也喪失了UC-MSC的特性。UC-NSC移植至大鼠腦出血模型后，能夠在宿主腦內(nèi)存活、遷移和分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。與PBS對(duì)照組相比，UC-NSC移植組的腦水腫和膠質(zhì)癱痕的發(fā)生明顯減少，且損傷區(qū)周圍IL-1p陽性細(xì)胞也少于對(duì)照組。