ADAM-17在腎透明細胞癌中的表達及靶向抑制ADAM-17對腎癌Notch通路的特異性影響以及分子機制的研究.pdf

1、背景:腎細胞癌是最常見的腎臟惡性實體腫瘤，是起源于腎實質泌尿小管上皮的惡性腫瘤。
　　目前的靶向藥物如索拉菲尼、舒尼替尼等多基于選擇性的抑制VEGFR2、3或者KIT、VEGFR-1等作用于腎癌細胞的多種信號通路從而發(fā)揮抗腫瘤作用，其中最重要的通路就是Notch信號傳導途徑。ADAM-17又名TACE作為一種早期發(fā)現(xiàn)的TNF-α抑制劑，研究表明，在白血病中Notch1蛋白的釋放依賴于ADAM-17對于Notch信號途徑的作用，揭示

2、了ADAM-17在Notch通路中的重要作用，其在Notch通路S2位點中起到了關鍵酶的作用。ADAM-17作為天然金屬蛋白的一種，而Marimastat，是金屬蛋白酶家族中唯一可抑制TACE的蛋白，Marimastat主要作用是能緊密連接基底膜，抑制TNF-α轉化酶，通過穩(wěn)定細胞表面TNF-α受體誘導程序性死亡。而由于其對抗TACE(ADAM-17)的作用，其通過Notch信號通路對腫瘤也引起了廣泛關注。
　　實驗設計思路為，與

3、ADAM-17在胞外S2位點的切割效應相比，γ分泌酶對Notch的S3位點切割位于跨膜區(qū)，跨膜區(qū)可以收到有多種信號通路的影響，由于腫瘤細胞信號通路是一個復雜的立體的結構，各信號通路有許多已知的、未知的相互影響，應用γ分泌酶抑制劑針對跨膜區(qū)γ分泌酶的作用不可避免的產(chǎn)生對其他信號通路的影響;而對于位于胞外區(qū)的S2位點來說，其受到影響的可能性遠比S3位點要小，所以，針對S2位點的阻滯應該會有更強的具有的特異性，與γ分泌酶抑制劑相比針對ADAM

4、-17進行抑制，在Notch通路中可以達到更好的抑制效果，對未來腎細胞癌的靶向抑制提供新的思路。
　　研究目的:腎腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制尚不清楚，Notch信號通路被認為在其中起到重要作用，本研究旨在研究Notch通路關鍵酶ADAM-17(TACE)在腎癌組織中的表達以及Notch通路的兩種抑制劑對腎癌786-O細胞以及OS-RC-2細胞增殖以及細胞侵襲影響的特異性研究
　　方法:1、ADAM-17在腎癌組織中的表達
　　

5、1.1腎癌組織的提取
　　收集2011年10月至2012年12月于山東大學附屬省立醫(yī)院泌尿微創(chuàng)科入住的腎腫瘤患者手術標本共67例，所有診斷由山東大學附屬省立醫(yī)院病理科石蠟切片確診，同時收集癌旁正常腎臟組織共10例;手術方式為開放腎癌根治性切除術或者手助腹腔鏡腎癌根治性切除術。手術患者均采用2009年AJCC的TNM分期和2004 WHO分級系統(tǒng)評價腎癌的臨床分期，并根據(jù)臨床分期進行分組。
　　1.2腎癌組織中ADAM-17的

6、免疫組化檢測
　　收集腎癌組織標本及正常腎臟組織標本后，選用兔抗人ADAM-17多克隆抗體，嚴格按照Super Polymer-二步法IHC試劑盒的方法進行脫蠟水化、抗原修復、IHC試劑盒實驗、蘇木精復染、DAB顯色、脫水透明、顯微成像系統(tǒng)拍照。ADAM-17陽性表達主要集中在細胞膜周圍，染色為棕紅色，而正常腎臟組織中腎臟細胞排列規(guī)整，無核分裂像，細胞周圍無此類染色表達情況，并統(tǒng)計陽性例數(shù)。
　　1.3 Western bl

7、ot方法檢測不同分期腎癌組織中ADAM-17的表達情況
　　將收集的腎癌組織根據(jù)不同臨床分期進行分組，其中臨床Ⅰ期、Ⅱ期腎癌組織作為一組、Ⅲ期與Ⅳ期作為一組，正常腎臟組織作為一組，不同分期腎癌組織隨機抽取3例，分別提取總蛋白，腎癌組與正常腎組織組分別進行Western blot檢測觀察各組ADAM-17蛋白表達情況。以GAPDH作為內參照，以各組ADAM-17與GAPDH的比值表示各組ADAM-17蛋白表達水平。用掃描儀掃描膠片得

8、到各個蛋白條帶圖，將得到的數(shù)據(jù)導入IPP6.0圖像處理軟件，通過軟件中的count/size算出各蛋白個條帶的光密度值IOD(Integral OpticalDensity)，然后計算各個目的蛋白條帶和與之相對應的內參條帶的灰度值的比。
　　2、抑制ADAM-17對腎癌Notch通路調控特異性的研究
　　2.1腎癌細胞株的選擇
　　選取腎癌786-O細胞株以及腎癌OS-RC-2細胞株，二者均購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫

9、。兩類細胞均嚴格按照細胞培養(yǎng)規(guī)程進行復蘇、培養(yǎng)、傳代以及凍存。
　　2.2實驗試劑處理及細胞分組
　　ADAM-17抑制劑Marimastat規(guī)格1mg購自英國Tocris公司;DAPT;格5mg購自美國EMD bioscience公司。將Marimastat及DAPT試劑于常溫下解凍，分別溶于DMSO中，根據(jù)體積比配置成Marimastat1μmol/L，2μmol/L，3μmol/L以及DAPT1μmol/L，2μmol

10、/L，3μmol/濃度溶液4℃冰箱保存待用。于細胞培養(yǎng)時各濃度試劑均取2ml加入處于對數(shù)生長期的786-O以及OS-RC-2細胞內處理24h作為實驗組;對照組僅加入2m11640培養(yǎng)基。
　　2.3 Western blot方法檢測兩類抑制劑對786-O細胞以及OS-RC-2細胞Notch通路的影響
　　分別將不同濃度的Marimastat以及DAPT加入到培養(yǎng)中的786-O細胞以及OS-RC-2細胞中，對其Notch1、H

11、es-1蛋白表達進行檢測，取未經(jīng)處理的細胞作為對照組作比較，蛋白下降程度我們用測量的蛋白濃度-對照組蛋白濃度計算，下降程度均數(shù)±標準差表示((x)±σ)，實驗步驟參考方法1.3進行。
　　2.4 CCK-8法檢測經(jīng)兩類抑制劑處理后的細胞增殖情況
　　取經(jīng)過不同濃度Marimastat以及DAPT處理后的786-O細胞以及OS-RC-2細胞，均以3×105/mL的密度種于普通96孔板中，每孔加入100μ l細胞懸液。24h后用

12、CCK-8法檢測細胞活力。酶標儀于450nm處檢測0D值情況。下降程度以實驗組數(shù)據(jù)減去對照組數(shù)據(jù)，取各組實驗值的均數(shù)表示，每組實驗均重復三次。
　　2.5 Transwell侵襲小室檢測兩類抑制劑對786-O細胞侵襲性的影響
　　Transwell試劑盒購買自美國Corning公司。我們選取腎癌786-O細胞分別經(jīng)1μmol/L，2μmol/L，3μmol/L的Marimastat以及相同濃度DAPT處理，對照組不進行任何處

13、理，經(jīng)過Transwell侵襲小室實驗，在400倍光學顯微鏡下隨機5個視野觀察穿過聚碳酸酯膜細胞的個數(shù)，以均數(shù)±標準差((x)±σ)表示。
　　結果:1.ADAM-17在腎癌組織中的表達
　　全部67例不同分期腎細胞癌組織及正常腎組織均完成正常免疫組化程序，通過免疫組化染色的方法發(fā)現(xiàn)，在不同TNM分期腎癌組織中，ADAM-17呈高表達，全部67例中陽性表達為43例，占64.18％，而ADAM-17陰性表達者僅有24例，占35

14、.82％，通過對上述計數(shù)資料進行統(tǒng)計學分析，在腎癌組織中，ADAM-17陽性表達比例增多，差距有顯著統(tǒng)計學意義（x2=16.39 P＜0.01）。在留取的10例腎癌旁正常的腎臟組織中，ADAM-17無一例呈表達。在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期與Ⅳ期ADAM-17陽性表達的腎癌中，進行Western blot檢測，其相對光密度值分別為Ⅰ期腎癌(0.67±0.11)、Ⅱ期腎癌(0.73±0.31)、Ⅲ期腎癌(0.79±0.25)與Ⅳ期腎癌(0.89±0

15、.09)。
　　2.抑制ADAM-17對腎癌Notch通路調控特異性的研究
　　發(fā)現(xiàn)于無論經(jīng)過Marimastat或者DAPT處理的兩類細胞，其Notch1、Hes-1蛋白表達均明顯下降(P＜0.05)，但是，經(jīng)Marimastat處理的786-O細胞，比較經(jīng)過各濃度DAPT處理后Notch1蛋白、Hes-1蛋白下降更為顯著;在OS-RC-2細胞中，也得到了相似的結果，經(jīng)過Marimastat處理后，腎癌細胞Notch1、H

16、es-1蛋白的下降程度，相比經(jīng)DAPT處理后的下降程度要更大（786-O P＜0.05，OS-RC-2 P＜0.05）。并且，在相同濃度(1-4μmol/L)下，經(jīng)過Marimastat處理的兩類細胞兩種蛋白濃度比較經(jīng)過DAPT處理的下降程度更大，差距有統(tǒng)計學意義(P＜0.05 P＜005)。在cck-8實驗中發(fā)現(xiàn)兩類細胞經(jīng)過上述兩種抑制劑處理后，其OD值均有明顯下降，與此同時我們發(fā)現(xiàn)，在相同劑量下，經(jīng)過Marimastat處理的786

17、-O細胞相較于DAPT處理的細胞，OD值下降程度的更小，而相同的情況也出現(xiàn)在OS-RC-2細胞里，且經(jīng)過統(tǒng)計學分析，差異與計量呈相關性(r=0.991，P＜0.05，r=0.991，P＜0.05)。
　　結論:1、ADAM-17在腎癌組織中呈高表達，ADAM-17陽性表達隨腫瘤分期的增加其表達相應增加
　　2、對于高分期腎細胞癌，ADAM-17的陽性表達能上調腎癌細胞增殖，進而影響腎癌的侵襲及發(fā)展
　　3、抑制ADAM

18、-17表達可能成為腎癌靶向治療的新位點
　　4、Marimastat以及DAPT均可以降低Notch1蛋白以及Hes-1蛋白的表達，降低786-O細胞以及OS-RC-2細胞的增殖能力，在786-O細胞中可以降低癌細胞侵襲性以及提高其凋亡率
　　5、Marimastat對于兩類細胞Notch通路、細胞侵襲性以及細胞周期及凋亡率的影響比DAPT要更為顯著，Marimastat對于腎癌細胞Notch通路影響以及腎癌發(fā)生發(fā)展的過程具