Notch信號通路在T1期腎透明細胞癌轉(zhuǎn)移中的作用及其機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 腎癌的致死率在泌尿系統(tǒng)腫瘤排名第二，約占全部腫瘤的2％。根據(jù)2009年AJCC腎癌的TNM分期，T1期腎癌是指局限于腎臟，最大徑≤7cm的腫瘤。大多數(shù)T1期腎癌都是局限性腫瘤，但是有少部分T1期腎癌會伴有腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的癥狀，即T1期轉(zhuǎn)移性腎癌。這部分病人往往病情兇險，腫瘤進展迅速，生存時間較短。目前臨床上對于T1期腎癌的手術治療方案尚存爭論，通常對于T1期局限性腎癌一般行保留腎單位手術，而對于T1期轉(zhuǎn)移性腎癌則

2、需行根治性腎切除術。然而除了影像學證據(jù)之外，臨床上還沒有發(fā)現(xiàn)一種可以用于鑒別腎癌能否發(fā)生早期轉(zhuǎn)移的分子靶標，因此少數(shù)局限性腎癌患者行保留腎單位手術后出現(xiàn)腫瘤進展，不得不接受二次手術治療，并且往往預后不佳。
　　 Notch信號通路是一個在不同物種進化中相對高度保守的細胞之間信號傳遞的通路。在脊椎動物中，Notch受體家族包括四個成員(Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)；Notch配體家族包括五個成員(Jag

3、ged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4)。Notch信號通路的作用包括控制細胞的分化、增殖和凋亡，它在胚胎發(fā)育和細胞命運的決定中發(fā)揮了重要的作用。有研究報道，Notch信號通路參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展但根據(jù)組織的不同，Notch信號通路可能發(fā)揮促癌或者抑癌的生物學作用。
　　 到目前為止，Notch信號通路在腎癌轉(zhuǎn)移中的作用及其機制尚不明確。正是由于Notch信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性以及它在腎癌作用機制上的不

4、確定性，本文作者試圖通過深入的研究探尋Notch信號通路在腎癌，尤其是早期腎癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的具體作用，以期為臨床上預防和治療腎癌提供理論依據(jù)。方法：
　　 1、組織標本：收集中國人民解放軍總醫(yī)院2009年至2010年51例腎透明細胞癌組織標本，包括25例轉(zhuǎn)移性腎癌、26例局限性腎癌及其配對的瘤旁非腫瘤腎皮質(zhì)組織。
　　 2、細胞培養(yǎng)：正常人腎近曲小管上皮細胞株HKC以及腎透明細胞癌細胞株786-O和Caki-1。

5、　　 3、RNA提取和熒光定量PCR：使用總RNA提取試劑盒提取總RNA后再利用第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。熒光定量PCR采用SYBER Green染料法比較Ct值。
　　 4、蛋白提取和Western-blot：RIPA裂解液提取組織及細胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗和二抗等步驟之后ECL發(fā)光檢測目的條帶。
　　 5、質(zhì)粒構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染：將對照空白質(zhì)粒(pCMV6-Entry

6、)、Notch1表達質(zhì)粒(pCMV6-Notch1，)和Jaggedl表達質(zhì)粒(pCMV6-Jagged1)使用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)。
　　 6、MTS法檢測細胞增殖：細胞轉(zhuǎn)染后加入MTS試劑，然后用酶標儀在490nm波長下讀取吸光值檢測細胞增殖的變化。
　　 7、Transwell法檢測細胞遷移：將轉(zhuǎn)染后細胞鋪板于Transwell小室中，檢測細胞遷移能力的變化。
　　 8、流式細胞儀法檢測細胞周期：轉(zhuǎn)染后將細

7、胞收集、固定和染色后使用流式細胞儀檢測細胞周期的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、在HKC和786-O細胞株上，Notch1和Jagged1在mRNA和蛋白質(zhì)水平都有表達；Notch1和Jagged1在腫瘤細胞株的表達水平高于正常腎皮質(zhì)細胞株。
　　 2、腫瘤組織Notch1和Jagged1在mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平均顯著性高于瘤旁正常腎組織。Notch1在轉(zhuǎn)移性腎癌中的表達水平高于局限性腎癌組織；Jagged1

8、則相反，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　 3、在不同分期的腫瘤組織中，Notch1僅在T1期轉(zhuǎn)移性腎癌組織的表達顯著高于局限性腎癌。Jagged1的表達水平在各組分期中都沒有顯著性差異。
　　 4、T1期轉(zhuǎn)移性腎癌的平均直徑顯著大于T1期局限性腎癌的平均直徑。Notch1的表達水平和腫瘤直徑呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義；Jagged1的表達與腫瘤直徑?jīng)]有相關性。
　　 5、Notch1和Jagged1可以顯著促進腫瘤細胞

9、株786-O和Caki-1的增殖能力。但僅有Notch1能夠促進正常腎臟上皮細胞株HKC的增殖，Jagged1則不行。
　　 6、Notch1和Jagged1可以顯著促進腫瘤細胞株786-O和Caki-1的遷移能力。在兩株細胞株中過表達Notch1和Jagged1之后，轉(zhuǎn)移相關性基因MMP-9的mRNA表達水平顯著增加。
　　 7、過表達Notch1和Jagged1并不影響所有細胞株細胞周期的變化并且細胞周期相關基因P2