1800株G-桿菌插入序列共同區(qū)和整合子的耐藥機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 隨著抗生素的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,細(xì)菌的耐藥性就越來(lái)越嚴(yán)重。我國(guó)是世界上濫用抗生素最為嚴(yán)重的地區(qū)之一,細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題已經(jīng)引起人們的高度關(guān)注。我國(guó)目前臨床上分離的細(xì)菌對(duì)常規(guī)抗生素的耐藥率逐年上升,而且細(xì)菌在異常的抗生素選擇壓力下,產(chǎn)生多重耐藥的情況不斷出現(xiàn),因此研究細(xì)菌耐藥機(jī)制是十分必要和緊迫的。
　　 細(xì)菌耐藥的生化機(jī)制非常復(fù)雜,通常是細(xì)菌對(duì)藥物作用靶位、滲透性的改變,產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶,排外系統(tǒng)的作

2、用以及生物膜的產(chǎn)生等方面。而從分子生物學(xué)角度認(rèn)識(shí)細(xì)菌的耐藥機(jī)制,主要集中于基因突變和耐藥基因水平傳播?；蜣D(zhuǎn)移是細(xì)菌耐藥性迅速擴(kuò)散的主要因?yàn)?。攜帶耐藥基因的基因轉(zhuǎn)移元件有:質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合型噬菌體和整合子,以及最近幾年才發(fā)現(xiàn)的插入序列共同區(qū)(ISCR)。耐藥基因可以通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)座等方法在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移。通過(guò)轉(zhuǎn)座的方式,整合子、ISCR和轉(zhuǎn)座子可以導(dǎo)致多個(gè)耐藥基因在單個(gè)質(zhì)粒中聚集成束,這是多重耐藥株產(chǎn)生的重要因?yàn)椤?br>　　

3、 ISCR由“insertion sequences”(Iss)和“common regions”(CRs)得來(lái)。它既具有插入序列(Iss)的特點(diǎn),也具有共同區(qū)(CRs)的特點(diǎn)。插入序列屬于高度可移動(dòng)性轉(zhuǎn)座因子,是對(duì)基因組一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)具有插入能力的小分子DNA片段,并常可以移動(dòng)鄰近的基因。共同區(qū)域(CRs)是1993年在復(fù)雜性Ⅰ類整合子In6 andIn7中作為一個(gè)長(zhǎng)約2154bp的DNA片段而首先發(fā)現(xiàn)的。CRs是一類IS91-li

4、ke因子家族的延伸成員,它具有與相似位置IS91-like因子的兩個(gè)主要特點(diǎn):缺少末端反向重復(fù)序列和它們轉(zhuǎn)移鄰近耐藥基因是通過(guò)滾環(huán)復(fù)制的形式進(jìn)行的,另外,CR序列還保留著IS91的第三個(gè)特點(diǎn),復(fù)制終止子序列terIS。相應(yīng)地,為了強(qiáng)調(diào)它們作為插入序列的同源性和它們被發(fā)現(xiàn)的歷史,研究假設(shè)它們是特定的ISCR因子。用來(lái)區(qū)分CRs的數(shù)字被保留下來(lái)以便區(qū)分不同的ISCRs,因此,CR1對(duì)應(yīng)ISCR1,CR2對(duì)應(yīng)ISCR2等。
　　 IS

5、CRs包含1個(gè)ORF序列,orf513。Off513基因編碼513個(gè)氨基酸序列產(chǎn)物,其功能與轉(zhuǎn)座酶相似,可以轉(zhuǎn)移基因盒。在復(fù)雜性Ⅰ類整合子中,orf513下游可以有由一種或以上的耐藥基因組成的基因盒,緊接著是qac/sul的3'-CS。ISCR常見(jiàn)的可以分為6類,目前研究較多的為1,2,3,4類,研究發(fā)現(xiàn)這幾種類型的ISCR均與耐藥基因的傳播相關(guān)。其中,最為重要的是ISCR1,它經(jīng)常出現(xiàn)在復(fù)雜性Ⅰ類整合子的基因序列中。ISCR1介導(dǎo)一系

6、列的轉(zhuǎn)座事件發(fā)生,轉(zhuǎn)座不同長(zhǎng)度的耐藥基因盒,如catA2、dfrA、qnr和各種blaCMY基因。ISCR1對(duì)耐藥基因的傳播發(fā)揮重要的作用。
　　 另一個(gè)重要的基因轉(zhuǎn)移元件是整合子。整合子是細(xì)菌的DNA片段,它的獨(dú)特結(jié)構(gòu)可捕獲并整合外源性基因,并使之轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄曰虻谋磉_(dá)單位。其整合的基因盒大多與耐藥基因有關(guān),對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)化和耐藥性具有重要意義。根據(jù)整合酶不同進(jìn)行分類,整合子主要分為Ⅰ～Ⅳ類。其中,Ⅰ類整合子最常見(jiàn)也是最早被發(fā)

7、現(xiàn)的整合子,其基因盒的移動(dòng)已得到證實(shí)。Ⅰ類整合子在革蘭陰性桿菌中通過(guò)可變區(qū)整合一個(gè)或多個(gè)耐藥基因盒介導(dǎo)宿主菌多重耐藥,在臨床檢測(cè)中具有重要的意義。這類整合子5'-保守區(qū)有編碼Ⅰ型整合酶的基因intI1、重組位點(diǎn)attI1和啟動(dòng)子Pant。3'-保守區(qū)由3個(gè)開(kāi)放閱讀框組成(qacE△I,sulI和ORF5),有的整合子沒(méi)有3’-保守區(qū)。Ⅰ類整合子在革蘭陰性菌中廣泛分布、檢出率最高,在許多臨床分離的菌株包括腸桿菌科中的埃希菌屬、克雷伯菌屬和

8、非發(fā)酵革蘭陰性桿菌中的假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬等都能檢出。Ⅰ類整合子可以攜帶多種耐藥基因,如 β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、甲氧芐啶、氯霉素、鏈霉素、喹諾酮和季銨類化合物等耐藥基因,對(duì)耐藥基因在革蘭陰性桿菌中的傳播十分重要。
　　 ISCR1經(jīng)常出現(xiàn)在復(fù)雜性Ⅰ類整合子的基因序列中。ISCR1上游序列通常是相同的,而在ISCR1與Ⅰ類整合子3'-保守區(qū)的連接點(diǎn)序列是不變的。這些都表明ISCR1很符合復(fù)雜性Ⅰ類整合子的特征。無(wú)論是ISCR

9、1連同耐藥基因插入到普通的一類整合子組成的復(fù)雜性整合子,還是帶有兩個(gè)拷貝ISCR1因子的復(fù)雜性整合子,它們都帶有許多耐藥性因子,具有廣泛傳播這些耐藥基因的潛能。復(fù)雜性Ⅰ類整合子所攜帶的多重耐藥基因是臨床研究多重耐藥所不可忽視的,這一結(jié)構(gòu)為研究多重耐藥的機(jī)制提供了更多的途徑和方向。
　　 中國(guó)是一個(gè)抗生素濫用比較嚴(yán)重的國(guó)家,細(xì)菌的耐藥情況也比其他國(guó)家或地區(qū)嚴(yán)重,細(xì)菌所攜帶的耐藥基因種類也相對(duì)較多。從科學(xué)研究方面看,這是一個(gè)豐富的資

10、源。如果對(duì)大量耐藥菌株進(jìn)行研究,肯定能發(fā)現(xiàn)很多新的耐藥相關(guān)信息,有利于臨床治療細(xì)菌的感染。
　　 ISCR1和Ⅰ類整合子都是細(xì)菌攜帶耐藥基因常見(jiàn)的重要基因元件,與耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。國(guó)外已經(jīng)有在多種菌種中的ISCR1的研究報(bào)道,但是中國(guó)國(guó)內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。而Ⅰ類整合子的研究雖然已經(jīng)很多,但是在中國(guó)還沒(méi)有研究是同時(shí)對(duì)大量不同菌種細(xì)菌同時(shí)進(jìn)行的。這是本研究的突破點(diǎn)和創(chuàng)新點(diǎn)。
　　 因此,本課題針對(duì)常見(jiàn)革蘭陰性桿菌進(jìn)

11、行ISCR1和Ⅰ類整合子耐藥基因的篩查,測(cè)序,得到新的耐藥基因組合,從而了解ISCR1,和Ⅰ類整合子的耐藥機(jī)制,以及初步了解這兩者的串聯(lián)關(guān)系。
　　 研究方法
　　 1.菌株的挑選及基因組DNA的提取 大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌是從2005年到2009年的菌株,分別在各年中挑選不重復(fù)的多重耐藥菌株,而其他細(xì)菌(陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、居泉沙雷菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食

12、單胞菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌、惡臭假單胞菌等)是從2008年到2009年兩年內(nèi)在臨床中收集的不重復(fù)的多重耐藥菌株。共收集到1800株細(xì)菌,用SDS-蛋白酶K-酚-氯仿方法抽提這些菌株的基因組DNA。
　　 2.ISCR1中orf513基因和可變區(qū)耐藥基因的檢測(cè) 引用國(guó)外已經(jīng)應(yīng)用的orf513基因相關(guān)引物對(duì)所提取的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,再用ISCR1可變區(qū)引物對(duì)orf513基因陽(yáng)性株進(jìn)行PCR的篩查,然后酶切可變區(qū)基因并進(jìn)行初步分類

13、,挑選各種類型測(cè)序,分析同源性和耐藥基因組合,GeneBank上申請(qǐng)序列號(hào)。
　　 3.Ⅰ類整合子中Ⅰ類整合酶基因和可變區(qū)耐藥基因的檢測(cè) 引用國(guó)內(nèi)外已經(jīng)應(yīng)用的相關(guān)Ⅰ類整合酶基因引物進(jìn)行Ⅰ類整合酶的篩查,得到陽(yáng)性株后再用國(guó)外研究中的引物進(jìn)行整合子可變區(qū)基因的檢測(cè),然后酶切可變區(qū)基因并進(jìn)行初步分類,挑選各種類型測(cè)序,分析同源性和耐藥基因組合,GeneBank上申請(qǐng)序列號(hào)。
　　 4.初步了解ISCR1與Ⅰ類整合子之間的串聯(lián)關(guān)

14、系 實(shí)驗(yàn)設(shè)想在既含有Ⅰ類整合子基因又含有ISCR1基因的菌株中,這兩者是串聯(lián)存在的,構(gòu)成復(fù)雜性Ⅰ類整合子。實(shí)驗(yàn)中用本研究設(shè)計(jì)的引物對(duì)Ⅰ類整合子靠近3'-保守區(qū)的基因和ISCR1的靠近5’-保守區(qū)的基因間的序列進(jìn)行PCR的檢測(cè)并測(cè)序分析。
　　 結(jié)論
　　 1.不同菌屬中ISCR1和Ⅰ類整合子攜帶的耐藥基因種類和數(shù)量不等。
　　 2.在不同種屬中分別發(fā)現(xiàn)了ISCR1和Ⅰ類整合子攜帶耐藥基因的新組合方式。