腺病毒介導(dǎo)的蛋白聚糖Ⅱ基因轉(zhuǎn)染對(duì)高糖環(huán)境下大鼠系膜細(xì)胞增殖，TGF-β1及細(xì)胞外基質(zhì)的作用.pdf

1、研究背景和目的 糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。高血糖環(huán)境中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的堆積是糖尿病腎病發(fā)生和進(jìn)展的最主要原因。越來越多的證據(jù)表明系膜細(xì)胞自分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是高血糖對(duì)腎臟作用的重要中介。高糖環(huán)境中下調(diào)TGF-β1信號(hào)的治療途徑為我們提供了一個(gè)抑制DN發(fā)生、發(fā)展的途徑。 蛋白聚糖Ⅱ，又稱decorin(DCN)是一個(gè)37KD，分泌性蛋白聚糖。D

2、CN可調(diào)節(jié)基本生物學(xué)功能，如基質(zhì)組裝，纖粘蛋白和血小板反應(yīng)素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)。更重要的是DCN是TGF-β1的天然拮抗劑。有證據(jù)說明DCN通過其核心蛋白與TGF-β1結(jié)合可以直接中和其活性。 為更好地揭示在高血糖環(huán)境下，上調(diào)DCN對(duì)TGF-β1活性、細(xì)胞增殖、細(xì)胞外1基質(zhì)堆積以及組織纖維化的抑制作用，并探討DCN基因轉(zhuǎn)染防治DN的可能性，本實(shí)驗(yàn)通過觀察腺病毒介導(dǎo)大鼠蛋白聚糖Ⅱ基因(AD-DCN)轉(zhuǎn)染對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞

3、的影響，從細(xì)胞水平闡明DCN基因轉(zhuǎn)染治療糖尿病腎病的可能性。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法 1. 在AD293細(xì)胞中，體外擴(kuò)增大鼠蛋白聚糖Ⅱ基因重組腺病毒(AD-DCN，由本實(shí)驗(yàn)組成員前期構(gòu)建完成)和大鼠β-半乳糖苷酶基因重組腺病毒(AD-Lacz，由國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室姚航平副研究員贈(zèng)與)，并測(cè)定其MOI值。 2.大鼠腎系膜細(xì)胞細(xì)胞株(HBZY-1)培養(yǎng)：HBZY-1分5組培養(yǎng)，分別按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入處理因子。高糖AD-Lacz病毒轉(zhuǎn)染

4、組(LACZ組)：DMEM-H(含葡萄糖4500mg/L)培養(yǎng)，AD-Lacz以MOI=50感染，轉(zhuǎn)染2小時(shí)后，更換不含病毒的培養(yǎng)液，為陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組；高糖AD-DCN病毒轉(zhuǎn)染組(DCN組)：DMEM-H(含葡萄糖4500mg/L)培養(yǎng)，AD-DCN以MOI=50感染轉(zhuǎn)染，2小時(shí)后更換不含病毒的培養(yǎng)液，為目的基因轉(zhuǎn)染組；正常糖對(duì)照組(N組)：DMEM-L(含葡萄糖1000mg/L)培養(yǎng)，為正常對(duì)照組；高糖組(H組)：DMEM-H(含葡萄

5、糖4500mg/L)培養(yǎng)，為高糖對(duì)照組；高糖TGF-β1中和抗體對(duì)照組(H-anti-TGF組)：DMEM-H(含葡萄糖4500mg/L)培養(yǎng)，TGF-β1中和抗體以3ng/ml的濃度中和，處理12小時(shí)換液。該組為陽(yáng)性對(duì)照組。 在各種因子處理后培養(yǎng)5天。 3.MTT法測(cè)定系膜細(xì)胞的增殖：在培養(yǎng)第1天(各種因子處理后24小時(shí))，第2天，第3天，第4天，第5天，分別用MTT法測(cè)定各組系膜細(xì)胞的增殖情況。 4.West

6、ernblot法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)：HBZY-1按上述分組培養(yǎng)，在培養(yǎng)第1天(各種因子處理后24小時(shí))，第2天，第3天，第4天，第5天，收集培養(yǎng)上清和提取大鼠腎系膜細(xì)胞的總蛋白，測(cè)定樣品蛋白總濃度，westernblot法測(cè)定上清DCN蛋白含量，系膜細(xì)胞TGF-β1，Ⅳ膠原(CollagenⅣ，C-Ⅳ)，纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)和層粘連蛋白(lamminin，LN)蛋白含量。同時(shí)測(cè)定β-actin蛋白作為內(nèi)參。膠片用

7、Epson公司的F-3200型掃描儀掃描，輸入計(jì)算機(jī)。TOTALLAB(V2005)軟件分析目的蛋白和β-actin蛋白的凈光密度值。目的蛋白和β-actin凈光密度的比值作為比較值。 5.統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Spss10.0軟件統(tǒng)計(jì)，兩樣本間2的比較t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本間的比較用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01有顯著差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1高糖對(duì)系膜細(xì)胞的作用：高糖促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖

8、，增殖作用在培養(yǎng)第1天出現(xiàn)，持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)點(diǎn)。高糖促進(jìn)系膜細(xì)胞TGF-β1合成和DCN分泌，其作用在第1天出現(xiàn)，持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)點(diǎn)。高糖增加ECM的合成，C-Ⅳ合成增加在培養(yǎng)后24小時(shí)即出現(xiàn)，而FN、LN合成增加出現(xiàn)在第3天，均持續(xù)至第5天。 2AD-DCN對(duì)高糖環(huán)境下的系膜細(xì)胞的作用：AD-DCN抑制高糖引起的系膜細(xì)胞增殖，其抑制作用出現(xiàn)于第4，第5天，較TGF-β1中和抗體(抑制細(xì)胞增殖的作用出現(xiàn)在第1天)的作用緩慢，

9、但第5天時(shí)兩組的抑制作用相似(P＞0.05)。AD-DCN轉(zhuǎn)染明顯增加系膜細(xì)胞培養(yǎng)上清中DCN蛋白含量。在培養(yǎng)第3天，培養(yǎng)上清中DCN含量顯著增加，分別是高糖組的141％和高糖Lacz組的134％，第5天培養(yǎng)上清中的DCN含量依然是5組中最高的，是高糖組的167％，是高糖Lacz組的143％。 AD-DCN轉(zhuǎn)染對(duì)系膜細(xì)胞TGF-β1蛋白合成的抑制作用在轉(zhuǎn)染的第3天出現(xiàn)，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)第5天；AD-DCN對(duì)系膜細(xì)胞合成C-Ⅳ，F(xiàn)N，L

10、N的抑制作用在轉(zhuǎn)染的第3天出現(xiàn)，持續(xù)至第5天，與TGF-β1中和抗體的抑制作用趨勢(shì)一致。在培養(yǎng)第5天，AD-DCN轉(zhuǎn)染組、TGF-β1中和抗體組和正常對(duì)照組間TGF-β1、C-Ⅳ、FN和LN的蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 3AD-Lacz對(duì)高糖環(huán)境下的系膜細(xì)胞的作用：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染的第1天對(duì)系膜細(xì)胞有輕微促增殖作用，并持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)段，但與高糖組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AD-Lacz對(duì)系膜細(xì)胞DCN蛋白合成無顯著影響，

11、與高糖組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AD-Lacz轉(zhuǎn)染后第1天可見系膜細(xì)胞TGF-β1、C-Ⅳ、FN和LN合成有輕度增加，與高糖組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，第3天，第5天這種影響已不明顯，與高糖組比較，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 結(jié)論 1高糖促進(jìn)大鼠腎系膜細(xì)胞的增殖，促進(jìn)DCN、TGF-β1、和細(xì)胞外基質(zhì)成分C-Ⅳ、FN和LN蛋白合成。 2但白聚糖Ⅱ重組腺病毒載體可在大鼠腎系膜細(xì)胞中高效表達(dá)目的蛋白DCN。