結核分桿桿菌NAD生物合成酶NaMNAT(Rv2421c)的分子伴侶功能.pdf

1、結核病疫情在世界范圍內的急劇惡化已引起全球廣泛關注。全球近1/3的人口感染過結核菌。更嚴重的是對一線藥物(異煙肼(Isoniazidum)、利福平(Rifampin)、鏈霉素(Sstreptomycin)和乙胺丁醇(Eethambatal))甚至二線藥物(乙硫異煙胺(Ethionamide)/丙硫異煙胺(Protionamide)、環(huán)絲氨酸(Cycloserine)、對氨基水楊酸(P-aminosalicylic acid))的耐受的菌

2、株層出不窮。致使人類的健康水平受到嚴重的威脅。因此，尋找更有效的藥物來治療這個頑固性疾病是擺在醫(yī)藥工作者面前的重要課題。輔因子的生物合成途徑是一個豐富的潛在藥物靶標資源庫。其中NAD是生物體中廣泛存在且必須的輔因子。NAD參與許多氧化還原反應，能量代謝，活細胞代謝調節(jié)，蛋白翻譯后的修飾，細胞凋亡，DNA修復，端粒的保護，基因沉默，細胞壽命，內分泌調節(jié)，免疫應答和鈣離子信號通路，NAD還是VB12的合成的前體物等重要的生物過程。我們利用基

3、因組對比分析和子系統(tǒng)注釋工具，憑借SEED基因操作平臺(http：//theseed.uchicago.edu/FIG/index.cgi)，重新構建了NAD在生物界中的合成途徑。到目前為止主要有六條途徑，分別是De novopathway(Try)，NmR pathway(NRK-依賴型)，NmR pathway(NRK-非依賴型)，Niacinrecycling。因此，研究NAD生物合成代謝的關鍵且保守的酶，并作為開發(fā)研制新型的抗結

4、核病的藥物靶標具有十分重要的現(xiàn)實意義。其中Mycobacterium tuberculosis擁有的是De novo pathway(Asp)和Niacin salavage兩條途徑，而NaNMAT，NADS，NADK是存在于M.tuberculosis兩條NAD生物合成途徑中的三個關鍵酶，因此是備受關注的潛在藥物靶標。
　　 本研究主要對結核分枝桿菌H37Rv的NaNMAT基因nadD(Rv2421c)的克隆、表達及活性研究，

5、并利用生物信息學對該基因編碼蛋白進行結構和功能的分析及預測。從GenBank數據庫中獲得結核分枝桿菌H37Rv的NaNMAT基因nadD的核苷酸序列，設計一對引物，以結核分枝桿菌H37Rv全基因組為模板，體外擴增獲得nadD基因。通過TA克隆，將PCR產物連接到pMD19-T SimpleVector，然后亞克隆至載體pET28a(+)中，經菌落PCR、質粒酶切以及序列測定證明成功構建了重組質粒pET28-nadD。將重組質粒轉化大腸桿

6、菌(Escherichia coli)BL21(DE3)對該重組蛋白質誘導表達，Ni+凝膠親和層析方法純化獲得高純度的重組NaNMAT。我們還將克隆出來的Rv2421c通過構建大腸桿菌和恥垢分枝桿菌之間的穿梭質粒pMV261的重組質粒，來研究過表達該酶對宿主菌的影響，重組NaNMAT恥垢分支桿菌的宿主菌對氧化壓力，紫外線照射，酸，堿，SDS，CuSO4等外界壓力條件的耐受性均增強。我們在體外利用胰島素的凝集實驗來證實NaNMA工具有分子