結(jié)核分枝桿菌Rv3807c基因的克隆、表達(dá)及功能鑒定.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是危害人類健康的主要傳染病之一，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結(jié)核病的病原體。結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的基因組全長為4411532bp，含有4044個(gè)基因，其中272個(gè)基因編碼未知功能的蛋白質(zhì)，1051個(gè)基因編碼具有保守序列的假定蛋白質(zhì)(Conserved hypothetical protein)。
　　 結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁是其賴以生存的重

2、要屏障，可以作為研發(fā)抗結(jié)核藥物的靶標(biāo)。分枝桿菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖、聚阿拉伯糖半乳糖和分枝菌酸三部分組成，其中聚阿拉伯糖半乳糖(Arabinogalactan,AG)是細(xì)胞壁的重要組成成分。阿拉伯糖基的活性供體是聚十異戊二烯磷酸阿拉伯糖(Decaprenyl-phospho-arabinose，DPA)。近幾年，隨著Rv3806c、Rv3790、Rv3791蛋白功能揭示，DPA特異的合成途徑逐漸被闡明。其由三個(gè)連續(xù)反應(yīng)組成：(1)磷酸核

3、糖轉(zhuǎn)移酶(Rv3806c)將5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)轉(zhuǎn)移到聚十異戊二烯磷酸(DP)分子上形成5-磷酸核糖聚十異戊二烯磷酸(5-P-DPR);(2)磷酸酶將5-P-DPR分子上的5-磷酸基團(tuán)水解后形成聚十異戊二烯磷酸核糖(DPR)；(3)差向異構(gòu)酶(Rv3790、Rv3791)催化DPR生成DPA。在此途徑中，催化5-P-DPR脫磷酸的磷酸酶未被鑒定。而與Rv3806c處于同一啟動(dòng)子的Rv3807c是一種由166個(gè)氨基酸組成的未知功

4、能的膜蛋白，通過蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測其具有磷酸酶活性，該蛋白被推測催化5-P-DPR生成了DPR。
　　 本論文的目的是(1)克隆結(jié)核分枝桿菌Rv3807c基因。(2)在大腸桿菌中表達(dá)Rv3807c基因。(3)確定Rv3807c基因的表達(dá)產(chǎn)物是否具有磷酸酶活性，是否參與催化5-P-DPR生成DPR這一反應(yīng)。
　　 本論文使用的方法與獲得的結(jié)果：
　　 1．用PCR方法擴(kuò)增目的基因Rv3807c
　　 從結(jié)核分枝

5、桿菌基因組數(shù)據(jù)庫中獲得TB Rv3807c基因的核苷酸序列，并以此設(shè)計(jì)PCR引物，在上下游引物中引入NdeI和BamHI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。用高保真DNA聚合酶以H37Rv基因組為模板成功擴(kuò)增出Rv3807c基因。
　　 2．構(gòu)建克隆載體pMD18T-Rv3807c
　　 純化PCR產(chǎn)物，并將其與pMD18T載體進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Novablue的感受態(tài)細(xì)胞中。用限制性內(nèi)切酶鑒定重組質(zhì)粒。
　　

6、 3．Rv3807c核苷酸序列的測定
　　 將pMD18T-Rv3807c重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測定，并進(jìn)行BLAST分析，不存在任何堿基突變。
　　 4．表達(dá)載體pET16b-Rv3807c與pCold-Rv3807c的構(gòu)建用NdeI和BamHI雙酶切pMD18T-Rv3807c重組質(zhì)粒，回收、純化Rv3807c基因，并通過NdeI和BamHI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)與表達(dá)載體pET16b和pCold連接，將重組質(zhì)粒pET

7、16b-Rv3807c和pCold-Rv3807c通過NruI單酶切與NdeI和BamHI雙酶切兩種酶切方法進(jìn)行鑒定。
　　 5．Rv3807c基因在大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)和Er2566(DE3)中表達(dá)并用SDS-PAGE和Western blotting方法檢測
　　 將重組質(zhì)粒pET16b-Rv3807c轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)和Er2566(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，以及重組質(zhì)粒pCold-Rv3807c轉(zhuǎn)

8、化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，并用SDS-PAGE和Western blotting方法檢測，結(jié)果表明Rv3807c在大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)和Er2566(DE3)中成功表達(dá)。
　　 6．用Ni-NTA-Agarose親和柱層析嘗試純化在大腸桿菌中Rv3807c基因過表達(dá)的蛋白。
　　 7．用超速離心方法提取Rv3807c基因表達(dá)的膜蛋白，并用SDS-PAGE和Western blotting方法進(jìn)行檢

9、測。
　　 8．Rv3807c蛋白質(zhì)酶活性的測定
　　 薄板層析(TLC)法：以DP與PRPP作為底物，加入Rv3807c表達(dá)的蛋白質(zhì)后，中間產(chǎn)物5-P-DPR與終產(chǎn)物DPR量的變化，其中需要磷酸轉(zhuǎn)移酶Rv3806c過表達(dá)蛋白質(zhì)的參與。
　　 本論文利用分子克隆技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌Rv3807c基因進(jìn)行克隆，并使其在大腸桿菌中進(jìn)行了可溶性表達(dá)，通過超速離心提取出Rv3807c基因表達(dá)的膜蛋白，并用薄板層析的方法對該