人MxA基因重組真核載體抗乙型肝炎病毒作用的實(shí)驗(yàn)室研究.pdf

1、第一部分人MxA基因重組真核載體的構(gòu)建及鑒定 目的：在前期獲得含有目的基因MxA的PAdtrack-MxA(含MxA的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒)基礎(chǔ)上，應(yīng)用真核載體PcDNA3.1構(gòu)建重組真核載體PcDNA3.1-MxA。 方法：在大腸桿菌JM109中擴(kuò)增獲得含有目的基因MxA的PAdtrack-MxA和PcDNA3.1，使用兩者共同的限制性?xún)?nèi)切酶Xba Ⅰ、NotⅠ進(jìn)行雙酶切，并連接以構(gòu)建重組真核載體PcDNA3.1-MxA

2、，然后通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選，雙酶切及PCR鑒定，選取鑒定正確的克隆測(cè)序，并應(yīng)用DNAssist 2.0軟件對(duì)序列與前期獲得的基因序列以及已知GenBank中MxA基因序列進(jìn)行同源性分析。 結(jié)果：經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶、PCR鑒定重組真核載體PcDNA3.1-MxA構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所克隆片段長(zhǎng)2012bp，包含人MxA基因序列，核苷酸序列分析表明與前期獲得的目的基因序列完全相同，而與GenBank中人MxA基因序列同源性也達(dá)

3、99.75％，僅有5個(gè)堿基不同，且所編碼的氨基酸僅1個(gè)發(fā)生改變，此氨基酸位于MxA蛋白的非功能區(qū)。 結(jié)論：重組真核載體PcDNA3.1-MxA構(gòu)建成功，為下一步研究重慶市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目編號(hào)：03125MxA抗乙型肝炎病毒作用奠定了基礎(chǔ)。 第二部分人MxA基因重組真核載體抗乙型肝炎病毒作用的實(shí)驗(yàn)室研究 目的：體外研究PcDNA3.1-MxA體外抗HBV的作用，為進(jìn)一步研究體內(nèi)抗病毒及臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4、 方法：將構(gòu)建成功的重組真核載體PcDNA3.1-MxA轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15，根據(jù)PcDNA3.1-MxA新霉素抗性，使用G418抗性篩選出穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。將HepG 2.2.15分為實(shí)驗(yàn)組(穩(wěn)定表達(dá)PcDNA3.1-MxA的HepG 2.2.15)和對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)，應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)兩組HepG2.2.15內(nèi)MxA mRNA水平的表達(dá)，并應(yīng)用ELISA法檢測(cè)兩組HepG2.2.1 5內(nèi)HBsAg、HBeAg的水平。

5、 結(jié)果：經(jīng)濃度梯度篩選顯示G418最適篩選濃度為600μg/ml，并在培養(yǎng)第3周篩選出穩(wěn)定表達(dá)PcDNA3.1-MxA的HepG 2.2.15。RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的MxA mRNA水平均較對(duì)照組明顯升高，而且ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組HBsAg、HBeAg水平明顯低于對(duì)照組，其結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論：在HepG 2.2.15內(nèi)成功轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)重組真核載體PcDNA3.1-MxA，