干擾素刺激基因ISG20的真核表達(dá)及其抗乙型肝炎病毒作用與機(jī)制研究.pdf

1、本文對(duì)干擾素刺激基因ISG20的真核表達(dá)及其抗乙型肝炎病毒作用與機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：干擾素刺激基因ISG20的真核表達(dá)及其抗乙型肝炎病毒作用的研究。
　　目的：ISG20因可由IFN誘導(dǎo)生成被發(fā)現(xiàn)，是除經(jīng)典的IFN效應(yīng)蛋白外的又一重要效應(yīng)因子，具有核酸外切酶的活性，多項(xiàng)研究證明其具有廣泛抗病毒的作用，本部分研究擬體外驗(yàn)證其抗HBV作用，及該作用是否與其核酸外切酶活性相關(guān)。
　　方法：選取

2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了HBV并能在上清表達(dá)病毒標(biāo)志物的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15細(xì)胞，體外構(gòu)建野生型及失去核酸外切酶活性的突變型ISG20過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，以驗(yàn)證ISG20的體外抗HBV作用，探討其抗 HBV作用是否與核酸外切酶活性相關(guān)，同時(shí)為進(jìn)一步證實(shí)ISG20抗HBV活性與其核酸外切酶活性的相關(guān)性，比較了轉(zhuǎn)染無(wú)核酸外切酶活性 ISG20的細(xì)胞組與空載體組經(jīng) IFNα處理后，細(xì)胞上清液HBV病毒標(biāo)志物的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：與突變型和對(duì)照

3、組相比，轉(zhuǎn)染了野生型 ISG20的細(xì)胞組上清液病毒標(biāo)志物表達(dá)水平下降，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在預(yù)先用IFNα處理的轉(zhuǎn)染無(wú)核酸外切酶活性ISG20細(xì)胞組與對(duì)照組中，IFNα的抗HBV活性在無(wú)核酸外切酶活性ISG20過(guò)表達(dá)組受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：野生型ISG20對(duì)HBV病毒復(fù)制具有抑制作用，且這種作用與其核酸外切酶活性密切相關(guān)，而無(wú)核酸外切酶活性的ISG20對(duì) IFNα的抗HBV作用有負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。
　　第二

4、部分：干擾素刺激基因ISG20抑制乙型肝炎病毒復(fù)制作用機(jī)制的初步探索。
　　目的：ISG20最早因IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生被發(fā)現(xiàn)，作為其效應(yīng)蛋白之一，可在PKR、2ˊ5ˊOAS/RNaseL、Mx三重基因缺陷的情況下，仍表現(xiàn)出活躍的抗病毒活性，IFN誘導(dǎo)ISG20產(chǎn)生由其啟動(dòng)子序列特異的ISRE結(jié)構(gòu)位點(diǎn)介導(dǎo)，此外，ISG20啟動(dòng)子中還包含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，可由dsRNA直接誘導(dǎo)經(jīng)由NF-κB位點(diǎn)啟動(dòng)抗病毒反應(yīng),因此，本研究擬探索 IS

5、G20抗 HBV作用的可能機(jī)制是否與啟動(dòng)子區(qū)域 ISRE和NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)。
　　方法：聯(lián)合JAK1/JAK2高選擇性通路抑制劑Ruxolitinib和NF-κB通路抑制劑BAY11-7082，對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV的肝癌細(xì)胞系進(jìn)行處理，檢測(cè)各組細(xì)胞通路下游信號(hào)分子的表達(dá)水平及明確 ISG20的表達(dá)在各組是否存在差異。
　　結(jié)果：使用兩種不同濃度的特異性 JAK1/JAK2抑制劑 Ruxolitinib處理HepG2.2.

6、15細(xì)胞，結(jié)果表明，經(jīng)Ruxolitinib處理的細(xì)胞，其p-JAK1、p-STAT1蛋白的表達(dá)水平下降，表明抑制劑在細(xì)胞中發(fā)揮作用， IFN處理組 ISG20的表達(dá)水平與對(duì)照組相比較高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)IFN誘導(dǎo)ISG20表達(dá)的作用；同時(shí)IFN處理組與IFN+Ruxolitinib處理組相比，ISG20的表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)照組與Ruxolitinib處理組相比，ISG20的表達(dá)水平較高，差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表

7、明抑制劑處理后，ISG20的表達(dá)水平下降。使用兩種不同濃度特異性的 NF-κB抑制劑 BAY11-7082處理HepG2.2.15細(xì)胞，所得結(jié)果相似，結(jié)果表明，p-NF-κB、p-IκBa蛋白表達(dá)在BAY11-7082處理組下降，表明抑制劑在細(xì)胞中發(fā)揮作用；對(duì)照組，BAY11-7082處理組兩組細(xì)胞ISG20蛋白及mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示特異性的NF-κB抑制劑BAY11-7082作用于HepG2.2.15細(xì)胞后對(duì)ISG2