蒼耳子提取物抗乙型肝炎病毒實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]：通過體外細(xì)胞培養(yǎng)和雛鴨體內(nèi)試驗(yàn)，探討不同濃度的蒼耳子提取物對HBV的影響。 [方法]：體外實(shí)驗(yàn)選用HBVDNA轉(zhuǎn)染的HepG22.2.15細(xì)胞，分別加入含有蒼耳子提取物10mg/ml、1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml的培養(yǎng)液，作用2d、4d、6d，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法篩選出蒼耳子提取物無毒濃度，再以免疫熒光法、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、放射免疫定量法(IRMA)及熒光定

2、量PCR等方法，檢測不同時間藥物對細(xì)胞分泌的HBsAg、HBeAg、HBcAg及HBVDNA的影響。同時以3TC(50μg/ml)、IFN-α(1000U/ml)組作為陽性藥物的無毒濃度組，不加藥組作細(xì)胞病毒對照。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以鴨乙型肝炎病毒(DHBV)DNA陽性雛鴨作動物模型，分別給予1mg·kg-1·d-1、0.1mg·kg-1·-1、0.01mg·kg-1·d-1的蒼耳子提取物，每天1次，連續(xù)給藥10d。定期采血，檢測用藥前后血清中谷

3、丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的變化，用斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢測藥物對鴨血清中DHBVDNA的影響，并取鴨肝作HE染色，觀察組織學(xué)變化；陽性對照藥給以3TC(2mg·kg-1·d-1)；病毒模型對照組和空白對照組(DHBVDNA陰性的雛鴨)，給予同體積的三蒸水。 [結(jié)果]：(1)體外試驗(yàn)：①用MTT法檢測藥物對2.2.15細(xì)胞的毒性作用，蒼耳子提取物毒性呈濃度依賴性，其中10mg/ml、1mg/ml濃度組分別在第2d及第6d出

4、現(xiàn)對2.2.15細(xì)胞的毒性作用(P＜0.05)；0.1mg/ml濃度以下實(shí)驗(yàn)組，6d內(nèi)對2.2.15細(xì)胞生長無毒性作用(P＞0.05)；3TC隨著濃度增加對2.2.15細(xì)胞的毒性亦增加，50μg/ml濃度組6d內(nèi)未見明顯細(xì)胞毒性(P＞0.05)；IFN-α各組在6d內(nèi)，未見細(xì)胞生長抑制現(xiàn)象(P＞0.05)。②用流式細(xì)胞術(shù)、放射免疫法檢測藥物對2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg、HBeAg及HBcAg的作用，蒼耳子提取物(0.1～0.001

5、mg/ml)組對HBsAg有抑制作用(P＜0.05)，其中0.1mg/ml組對HBsAg的抑制作用優(yōu)于3TC50μg/ml組(P＜0.05)；該濃度對HBeAg有抑制作用(P＜0.05)，但不優(yōu)于兩種陽性藥；0.01～0.001mg/ml組對HBeAg無抑制作用；三種濃度蒼耳子提取物對HBcAg均無抑制作用；3TC50μg/ml組對HBsAg、HBcAg均有顯著抑制作用(P＜0.05)，其毒性呈時間依賴性，對HBeAg有顯著抑制作用(P

6、＜0.01)；IFN-α1000U/ml組對HBsAg的抑制作用更明顯(P＜0.01)，隨培養(yǎng)天數(shù)增加，抑制率逐漸增加，至第6d時，抑制率達(dá)71.29％，對HBeAg、HBcAg有抑制作用(P＜0.05)；兩種陽性藥物比較，IFN-α1000U/ml組對HBsAg、HBcAg的抑制作用優(yōu)于3TC50μg/ml組(P＜0.05)，在同一時間內(nèi)IFN-α1000U/ml對HBeAg的抑制作用與3TC50μg/ml組無差異(P＞0.05)。③

7、用熒光定量PCR法檢測HBVDNA，三種濃度的蒼耳子提取物可降低HBVDNA拷貝數(shù)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。3TC50μg/ml組對HBVDNA有顯著抑制作用(P＜0.05)，IFN-α1000U/ml抑制作用更明顯(P＜0.01)。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：①用賴氏比色法對ALT和AST進(jìn)行檢測，空白對照組和病毒模型對照組在實(shí)驗(yàn)期間ALT和AST結(jié)果穩(wěn)定，組間無差異(P＞0.05)；用藥期間與模型對照組比較，蒼耳子提取物各濃度組ALT及

8、AST水平無顯著性差異(P＞0.05)，表明該藥未對肝功能造成損害；陽性藥物對照組3TC(2mg·kg-1·d-1)在用藥第10d后，ALT升高，與同時期病毒模型組比較有差異(P＜0.05)，提示該濃度3TC對肝臟可能有一定的毒性。②鴨肝病理切片觀察可見，DHBVDNA陽性鴨肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯空泡變性，胞漿疏松，匯管區(qū)可見炎細(xì)胞浸潤，有點(diǎn)狀出血、壞死；隨著蒼耳子提取物濃度增高，肝細(xì)胞病變程度逐漸減輕，蒼耳子提取物(1g·kg-1·d-1)治

9、療的鴨肝細(xì)胞水腫程度明顯輕于病毒模型對照組；3TC組鴨肝細(xì)胞形態(tài)正常。③用斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢測鴨血清中的DHBVDNA，蒼耳子提取物各組治療5d(T5)、治療10d(T10)與治療0d(T0)比較，對DHBVDNA無抑制作用(P＞0.05)；陽性藥物3TC組，DHBVDNA量明顯減少(P＜0.05)，而停藥3d(P3)DHBVDNA明顯反彈(P＜0.05)。 [結(jié)論]：蒼耳子提取物體外實(shí)驗(yàn)可抑制2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBe