促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRHant)預(yù)防化療損傷性卵巢功能早衰的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　化療藥物的應(yīng)用使得各種腫瘤和免疫性疾病治愈率得到提高的同時(shí)，所帶來的并發(fā)癥越來越多地得到臨床醫(yī)師的重視。在女性生殖系統(tǒng)中，卵巢對化療藥物最敏感，長期大劑量的化療會破壞卵巢組織，引起卵巢功能障礙，使得女性患者出現(xiàn)卵巢早衰（PrematureoveryfailurePOF）的改變，臨床上主要表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕、更年期綜合征和老齡性疾病的提早發(fā)生，嚴(yán)重影響年輕婦女的生活質(zhì)量和自信心。因此，如何在使用化療藥物的同時(shí)，保存婦女

2、的卵巢功能及生殖功能是臨床上值得深入研究的重要課題，有著巨大的醫(yī)學(xué)需求。
　　目前許多國內(nèi)外學(xué)者已做了大量的研究，目的是尋找一種安全有效的方法，使化療藥物的卵巢損傷降到最低，主要研究方向集中在促性腺激素釋放激素類似物（Gonadotropin-releasing-HormoneanaloguesGnRHa）的應(yīng)用和組織冷凍保存-自體移植（CryoPreservation-autotransPlantation）方面。組織冷凍保存-

3、自體移植存在技術(shù)性、安全性、甚至倫理性問題需要進(jìn)一步解決，適用范疇較為局限，目前尚無發(fā)臨床推廣應(yīng)用，因此GnRHa成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。將GnRHa預(yù)防性應(yīng)用于化療前，通過抑制垂體FSH/LH的分泌，進(jìn)一步抑制卵巢中小卵泡的有絲分裂，保留大部分原始卵泡，從而增強(qiáng)卵巢儲備，化療周期結(jié)束后且停用GnRHa，原始卵泡能夠繼續(xù)發(fā)育成熟為各級卵泡。如果通過大量的實(shí)驗(yàn)或臨床統(tǒng)計(jì)證實(shí)GnRHa能夠保護(hù)化療中的卵巢，那么化療藥物損傷的問題就可能得到解決。

4、
　　促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing-HormoneGnRH）是由下丘腦合成和分泌的，通過誘導(dǎo)垂體FSH/LH的分泌，并進(jìn)一步誘導(dǎo)卵巢中各級卵泡的生長發(fā)育及排卵。GnRHa由通過替代GnRH結(jié)構(gòu)的不同位點(diǎn)產(chǎn)生，包括GnRH激動劑和GnRH拮抗劑。既往試驗(yàn)多采用激動劑作為研究對象,臨床應(yīng)用后，結(jié)果存在較大爭議，可能與其不能完全抑制女性下丘腦－垂體－卵巢軸（Hypothalamic-pituitary

5、-ovarianaxisHPOA），起效時(shí)間較晚，需2-3周，結(jié)果導(dǎo)致化療方案延遲；并且存在點(diǎn)火作用，導(dǎo)致血清性激素水平一過性升高，在此階段的卵巢易受化療藥物的損傷。促性腺激素釋放激素拮抗劑（GonadotropinreleasingHormoneAntagonist，GnRH拮抗劑，GnRHant），對HPOA有較強(qiáng)且完整的抑制作用，并且副作用、用藥劑量及時(shí)間均小于GnRH激動劑，表現(xiàn)為在數(shù)小時(shí)內(nèi)即出現(xiàn)促性腺激素的釋放減少，且不存在點(diǎn)

6、火效應(yīng)，是理想的GnRHa。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在探討GnRH拮抗劑預(yù)防性應(yīng)用對化療后卵巢組織結(jié)構(gòu)、卵巢內(nèi)分泌功能、各級卵泡數(shù)量、卵子受精、胚胎發(fā)育、離體顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)及內(nèi)分泌功能所起的一系列作用及機(jī)制，為臨床腫瘤治療和免疫性疾病中應(yīng)用大劑量的化療藥物前采用GnRH拮抗劑保護(hù)卵巢功能提供一定的理論依據(jù)。
　　研究目的與意義：
　　1通過探討單獨(dú)化療及GnRH拮抗劑聯(lián)合化療對大鼠卵巢儲備能力的影響，為GnRH拮抗劑的臨床應(yīng)用提供

7、理論依據(jù)；
　　2通過探討GnRH拮抗劑聯(lián)合化療對大鼠生殖功能及子代胎鼠生長發(fā)育的影響，揭示GnRH拮抗劑對化療患者遠(yuǎn)期生活質(zhì)量的影響；
　　3探討GnRH拮抗劑對化療損傷性卵巢功能早衰的預(yù)防作用與卵巢顆粒細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑的相關(guān)性，闡明GnRH拮抗劑可能的保護(hù)機(jī)制；
　　4探討GnRH拮抗劑對離體培養(yǎng)的人黃素化顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)與分泌功能的影響，闡明排除下丘腦-垂體的影響后，GnRH拮抗劑在卵巢局部水平所發(fā)揮的直接作

8、用。
　　研究方法：
　　1．構(gòu)建和評價(jià)化療損傷性POF動物模型
　　SD性成熟雌性大鼠，腹腔注射不同濃度（10mg/kg，20mg/kg，30mg/kg）環(huán)磷酰胺（CytoxanCTX）20天。用藥結(jié)束后，稱取大鼠體重，卵巢及子宮濕重；通過陰道脫落細(xì)胞涂片法檢測大鼠動情周期（EstrouscycleESC）變化；摘大鼠眼球取血，酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-linkedimmunosorbantassayELISA

9、）各組大鼠血清雌二醇（EstradiolE2）、血清促卵泡素（Follicle-stimulatinghormoneFSH）水平；卵巢組織HE染色，鏡下觀察卵巢組織結(jié)構(gòu)并計(jì)數(shù)各級卵泡數(shù)、總卵泡數(shù)；對重要臟器：心臟、肝臟、腎臟、肺臟HE染色，進(jìn)行病理學(xué)檢驗(yàn)。
　　2．分析西曲瑞克（第三代GnRH拮抗劑）的劑量-效應(yīng)關(guān)系
　　SD性成熟雌性大鼠，腹腔注射不同濃度（1μg/d，3μg/d，5μg/d）西曲瑞克（Cetrorelix

10、）10天，通過陰道脫落細(xì)胞涂片法檢測大鼠動情周期變化；停藥0天后摘眼球取血，ELISA法檢測各組血清FSH、血清黃體生成素（LuteinizinghormoneLH）水平；停藥第5天和第10天，分別摘眼球取血兩次，ELISA法檢測各組大鼠血清FSH、LH水平。
　　3．西曲瑞克對化療大鼠卵巢功能的影響
　　SD性成熟雌性大鼠，連續(xù)腹腔注射5μg/d西曲瑞克10天后，西曲瑞克5μg/d和CTX20mg/（kg·d）同時(shí)腹腔注射

11、，連續(xù)20d。停藥0天和停藥10天后分批處死50％的大鼠，各稱取體重，卵巢、子宮濕重；通過陰道脫落細(xì)胞涂片法檢測大鼠動情周期；大鼠摘眼球取血，ELISA法檢測各組大鼠血清E2、FSH水平；HE染色，鏡下計(jì)數(shù)各級卵泡數(shù)和卵泡總數(shù)；對卵巢組織進(jìn)行病理學(xué)檢測。
　　4．檢測西曲瑞克對化療大鼠生殖功能及子代胎鼠生長發(fā)育的影響
　　SD性成熟雌性大鼠，腹腔注射5μg/d西曲瑞克10天后，西曲瑞克5μg/d和CTX20mg/（kg·d）

12、同時(shí)腹腔注射，連續(xù)20天。停藥10天后，按雌、雄大鼠按照2：1比例合籠交配，第二日清晨作陰道精子涂片檢測以發(fā)現(xiàn)陰栓和查到精子為受孕標(biāo)志，為“受孕日”，用GD（Gestationday）表示。記錄各組孕鼠GD10、GD12、GD14、GD17、GD20體重變化，孕鼠于GD20脫頸處死，剖腹檢查妊娠結(jié)果；記錄子宮著床數(shù)，鏡下計(jì)數(shù)雙側(cè)卵巢黃體數(shù)，總胎仔數(shù)，活胎數(shù)，吸收胎及死胎數(shù)；計(jì)算大鼠交配率，妊娠率，吸收胎率，死胎率；各組活胎鼠逐一記錄胎仔

13、體重、體長、尾長，性別比(雄性％)；檢查胎鼠外觀有無異常，Bouins液固定后檢查胎鼠內(nèi)臟有無畸形及缺失，茜素紅透明骨骼染色檢測胎鼠骨骼有無畸形及缺失。
　　5．檢測GnRH拮抗劑對化療損傷性POF的預(yù)防作用與卵巢顆粒細(xì)胞線粒體凋亡途徑的相關(guān)性
　　透射電鏡技術(shù)檢測不同藥物處理后各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞超微形態(tài)結(jié)構(gòu)；利用熒光探針JC-1染色顆粒細(xì)胞細(xì)胞線粒體膜，激光共聚焦顯微鏡檢測顆粒細(xì)胞線粒體膜電位變化；原位末端標(biāo)記技術(shù)(TU

14、NEL)測定卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡指數(shù)（ApoptoticindexAI）；免疫印記（Westernblotting）方法檢測細(xì)胞色素Ｃ（CytochromeCCyt-C）在卵巢組織線粒體及胞質(zhì)空間分布情況及SP免疫組織化學(xué)方法檢測Cyt-C在卵巢顆粒胞漿的表達(dá)；同時(shí)SP免疫組化方法進(jìn)行顆粒細(xì)胞調(diào)亡指標(biāo)的檢測，包括凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B-celllymphoma/leukemia-2BCL-2），前凋亡蛋白BA

15、X，半胱氨酸基天冬氨酸特異性蛋白酶－3（CysteinylaspartatespecificproteinaseCaspase-3）的表達(dá)分析。
　　6．檢測GnRH拮抗劑對體外培養(yǎng)的人黃素化顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)及分泌功能的影響
　　收集首次在西京醫(yī)院婦產(chǎn)科輔助生殖中心行體外受精-胚胎移植（Invitrofertilization-embryoPlantationIVF-ET）的患者卵泡穿刺術(shù)后的黃素化顆粒細(xì)胞，進(jìn)行分離、純化、鑒定

16、及培養(yǎng)。不同濃度的CTX（0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）和不同濃度西曲瑞克（0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）與人顆粒細(xì)胞共同孵育24h后，同時(shí)不同濃度的西曲瑞克（10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）聯(lián)合孵育于化療藥物1000ng/ml前24h及化療中24h。處理結(jié)束后，MTT比色法檢測不同藥物處理組的顆粒細(xì)胞的抑制率；對藥物處理后的細(xì)胞進(jìn)行Hoe

17、chest33258染色，檢測顆粒細(xì)胞的存活狀態(tài)；透射電鏡技術(shù)檢測藥物處理后各組顆粒細(xì)胞超微形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化；ELISA法檢測藥物處理后顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2、孕酮（ProgesteroneP4）水平。
　　研究結(jié)果：
　　1．成功構(gòu)建穩(wěn)定的化療損傷性POF動物模型
　　經(jīng)過一系列藥物濃度篩選，結(jié)果表明CTX的卵巢毒性作用與藥物劑量呈正相關(guān)，其中20mg/kg.d連續(xù)使用20天的實(shí)驗(yàn)劑量最符合臨床POF病理學(xué)改變：卵巢明顯

18、纖維化、出血、壞死，各級卵泡數(shù)目顯著減少，特別是成熟卵泡和生長卵泡；大鼠動情周期紊亂，動情期及動情前期縮短，總周期數(shù)較少，主要表現(xiàn)為持續(xù)的動情間期；血清E2水平較低、FSH水平升高；同時(shí)心、肝、腎，肺等重要臟器未出現(xiàn)明顯出血、壞死等病理學(xué)變化。該模型用藥劑量和時(shí)間與臨床化療中維持最小安全劑量用藥的要求完全相一致，為下一步實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2．GnRH拮抗劑（西曲瑞克）的劑量－效應(yīng)關(guān)系分析
　　西曲瑞克的藥物－劑量效應(yīng)

19、關(guān)系表明，西曲瑞克對性腺軸具有可逆性抑制作用，并且與藥物劑量呈正相關(guān)，其中3μg/d，5μg/d，連續(xù)使用10天可完全抑制大鼠性腺軸功能，表現(xiàn)為FSH、LH持續(xù)較低水平，停藥后FSH、LH激素水平迅速上升，10天內(nèi)可完全恢復(fù)正常，因此西曲瑞克3μg/d，5μg/d均為安全有效劑量。這與西曲瑞克藥理學(xué)研究相符，即西曲瑞克當(dāng)使用臨床最低有效劑量0.25mg/d時(shí),可以使抑制作用持續(xù)，并且該藥物濃度既對雌二醇分泌及卵泡發(fā)育無負(fù)面影響，通過人與

20、動物用藥的換算公式（人與大鼠等效劑量換算系數(shù)為6.25）計(jì)算出大鼠有效性腺抑制劑量為5μg/d。
　　3．西曲瑞克對化療大鼠卵巢功能的保護(hù)作用
　　西曲瑞克5μg/d聯(lián)合應(yīng)用于化療（CTX20mg/kg.d）前10天和化療中20天，能夠保存了卵巢組織中大部分原始卵泡，使得總卵泡數(shù)基本不變，處于靜止期的卵泡可免受化療藥損害，保存卵巢儲備功能，同時(shí)卵巢組織纖維化程度降低，出血、壞死現(xiàn)象明顯減輕；停藥10天后原始卵泡能夠繼續(xù)發(fā)育成