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文檔簡介
1、酗酒既是個社會問題也是個醫(yī)學(xué)問題,因酗酒導(dǎo)致的急慢性酒精中毒、酒精性脂肪肝、慢性肝炎、肝硬化等疾病嚴(yán)重危害著人們的健康。大量飲酒過后,血液中乙醇濃度明顯升高,出現(xiàn)各種醉酒癥狀。乙醇主要在肝臟中通過乙醇氧化系統(tǒng)進(jìn)行代謝,同時產(chǎn)生大量自由基O2-·、OH·,以及乙醇自身產(chǎn)生的自由基C2H5O-和C2H5OH-,當(dāng)產(chǎn)生自由基超出了機(jī)體的清除能力,便造成機(jī)體組織損傷。所以普遍認(rèn)為乙醇導(dǎo)致肝損傷,其機(jī)制之一是通過激活O2產(chǎn)生自由基,導(dǎo)致肝細(xì)胞膜脂
2、質(zhì)過氧化及肝細(xì)胞損傷。
竹節(jié)人參(Panax Japonics.C.A.Mey)系五加科植物,為《中華人民共和國藥典》收載的名貴常用中藥,通常被認(rèn)為具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗衰老、抗疲勞、抗病毒、抗腫瘤、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)心血管系統(tǒng)、保護(hù)內(nèi)分泌系統(tǒng)、保護(hù)免疫系統(tǒng)等多方面的功能,其主要化學(xué)成份為竹節(jié)參皂苷?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),竹節(jié)人參總皂苷可顯著提高多種模型(如:運(yùn)動、衰老、腦缺血再灌注損傷、高脂血癥、等)動物血清、肝臟中
3、SOD、CAT、GSH-PX活性,同時降低MDA含量,從而抑制脂質(zhì)過氧化。因此,本研究利用循環(huán)超聲波提取了人工栽培的竹節(jié)人參總皂苷,高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測-質(zhì)譜(HPLC-ELSD-MS)分析了竹節(jié)人參皂苷單體及含量組成,并以抗氧化性為著手點(diǎn),研究了竹節(jié)人參總皂苷對模型小鼠、人胚肝細(xì)胞L-O2乙醇性損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)理,同時分析了不同竹節(jié)人參皂苷單體對乙醇損傷肝細(xì)胞L-O2的保護(hù)作用及作用機(jī)理,主要研究結(jié)果如下:
4、 1、通過竹節(jié)人參總皂苷提取,HPLC-ELSD分離獲得6個皂苷單體,通過標(biāo)準(zhǔn)品比對,結(jié)合HPLC-ESI-MS分析,可知分別為Rg1、Re、Rf、F3、Rg2和Rd,其在人參總皂苷中的含量分別為:12.23%、16.24%、16.95%、7.51%、8.53%和11.47%。
2、給乙醇性肝損傷模型小鼠灌胃給予竹節(jié)人參總皂苷,氣相色譜法(GC)測定小鼠血清、尿液中乙醇濃度,分光光度法測定小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草
5、轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性以及血清、肝組織中丙二醛(MDA)含量、還原型谷光甘肽(GSH)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性等生化指標(biāo),光鏡、透射電鏡觀察肝組織超微病理變化,研究竹節(jié)人參總皂苷對小鼠乙醇性肝損傷的保護(hù)效果及作用機(jī)制;結(jié)果顯示,竹節(jié)人參總皂苷不具有抑制乙醇在胃腸道吸收作用,但能顯著降低乙醇肝損傷模型小鼠血清ALT、AST酶活性及血清、肝組織MDA含量,提高模型小鼠
6、血清、肝臟中GSH含量和抗氧化酶GSH-PX、CAT、SOD的活性。在血清中,竹節(jié)人參總皂苷50 mg/kg劑量組小鼠血清GSH含量、GSH-PX、CAT和SOD活性與正常組小鼠無顯著性差異(P>0.05);在肝臟中,竹節(jié)人參總皂苷50 mg/kg劑量組小鼠肝臟GSH-PX、SOD活性可恢復(fù)至正常水平,與正常組小鼠無顯著性差異(P>0.05);GSH、CAT水平雖然顯著提高,但仍顯著低于正常組(P<0.01);竹節(jié)人參總皂苷(50 mg
7、/k)可降低肝組織病變,促進(jìn)肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常,肝索、肝竇無明顯異常,肝細(xì)胞體積逐漸恢復(fù)正常,細(xì)胞核染色質(zhì)分布較均勻,核膜整形光滑,線粒體結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常,內(nèi)(嵴)外膜完整,基質(zhì)均勻,但部分線粒體嵴仍有些紊亂。以上結(jié)果表明,竹節(jié)人參總皂苷具有提高機(jī)體抗氧化功能,特別是對肝細(xì)胞及細(xì)胞器線粒體的結(jié)構(gòu)完整性具有明顯的保護(hù)作用。
3、通過臺盼藍(lán)染色計數(shù)觀察竹節(jié)人參總皂苷對正常及乙醇損傷的肝細(xì)胞L-O2活性的影響,分光光度法測定肝細(xì)
8、胞內(nèi)液MDA含量和SOD、GSH-PX、CAT活性變化,以及RT-PCR分析肝細(xì)胞內(nèi)SOD1、SOD2、SOD3、GSH-PX1、GSH-PX2、CAT mRNA水平變化,研究竹節(jié)人參總皂苷對乙醇損傷人胚肝細(xì)胞L-O2的保護(hù)作用及作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對正常肝細(xì)胞,竹節(jié)人參總皂苷(100μg/mL)表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)L-O2增殖作用,當(dāng)竹節(jié)人參總皂苷濃度達(dá)400μg/mL時,則表現(xiàn)出明顯的抑制細(xì)胞增殖作用;對乙醇損傷的肝細(xì)胞L-O2,竹節(jié)人
9、參總皂苷(100μg/mL)表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用,其肝細(xì)胞內(nèi)液MDA含量、SOD、GSH-PX活性可恢復(fù)至正常水平(P>0.05),CAT活性雖顯著升高,但仍顯著低于正常組(P<0.01)。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),竹節(jié)人參總皂苷(100μg/mL)可促進(jìn)SOD1、SOD2、SOD3、GSH-PX1、GSH-PX2、CAT mRNA表達(dá),其中GSH-PX3顯著高于正常組(P<0.01),SOD1、SOD3與正常組無顯著差異(P>0.05),
10、SOD2、CAT雖顯著提高,但仍低于正常對照(P<0.01),該結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,說明竹節(jié)人參總皂苷發(fā)揮抗氧化作用與促進(jìn)抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT特別是SOD1、SOD3、GSH-PX3mRNA表達(dá)有關(guān)。
4、通過清除羥自由基(OH-)和超氧陰離子自由基(O2-·)試驗(yàn),進(jìn)行竹節(jié)人參總皂苷體外抗氧化能力評價。結(jié)果竹節(jié)人參總皂苷呈現(xiàn)出明顯的清除OH·效應(yīng),并且其效果優(yōu)于Vc,當(dāng)濃度為12.5-1600μg/m
11、L時,竹節(jié)人參總皂苷和Vc對OH·清除率分別為3.37-59.47%和3.10-31.79%;竹節(jié)人參總皂苷對聯(lián)苯三酚自氧化具有一定的抑制作用,能清除O2-·,但清除能力要低于Vc,當(dāng)濃度為12.5-1600μg/mL時,竹節(jié)人參總皂苷和Vc清除率分別為1.01-6.87%和0.89-15.98%。研究結(jié)果表明,竹節(jié)人參總皂苷在乙醇性肝損傷保護(hù)作用中,不僅可提高抗氧化劑GSH含量以及抗氧化酶GSH-PX、CAT、SOD的活性,同時具有直
12、接清除肝代謝過程產(chǎn)生的-OH、O2-·自由基,亦或者是兩者的協(xié)同作用達(dá)到對肝細(xì)胞的保護(hù)。
5、通過MTT法測定細(xì)胞存活率,分光光度法測定肝細(xì)胞內(nèi)液MDA含量、SOD及GSH-PX活性,研究竹節(jié)人參皂苷單體對乙醇損傷肝細(xì)胞L-O2的保護(hù)作用及作用機(jī)理。結(jié)果顯示,Rg10.16 mg/mL、Re1.28 mg/mL和Rf0.64 mg/mL可促進(jìn)正常肝細(xì)胞L-O2增殖,增殖率分別為22.68%、34.80%和28.47%(P<
13、0.01);Rd0.16mg/mL和F31.28 mg/mL對正常肝細(xì)胞L-O2生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用,抑制率分別為49.69%和43.33%(P<0.01)。對乙醇損傷的肝細(xì)胞L-O2,Rg10.16 mg/mL、Re1.28 mg/mL和Rf0.64 mg/mL具有明顯的保護(hù)作用,對細(xì)胞生長的抑制率由乙醇損傷模型組的50.37%分別降低為23.31%、26.90%和26.58%(P<0.01);Rd0.16mg/mL和F31.28
14、 mg/mL則加劇乙醇對肝細(xì)胞的損傷,抑制率高達(dá)83.18%和64.79%(P<0.01)。乙醇損傷模型組肝細(xì)胞L-O2內(nèi)乙醇代謝產(chǎn)生MDA含量、抗氧化酶SOD和GSH-PX活性分別為1.35±0.05μmol/mL、26.45±2.78 U/mL和67.04±4.27U/mL,Rg10.16 mg/mL、Re1.28 mg/mL和Rf0.64 mg/mL可降低乙醇損傷的肝細(xì)胞L-O2內(nèi)MDA含量,分別降低為1.17±0.04、1.21
15、±0.03和1.21±0.05μmol/mL(P<0.01);提高SOD活性,分別升高為38.32±4.85、35.58±4.43和38.96±3.27 U/mL(P<0.01);增強(qiáng)GSH-PX活性,分別升高為86.30±5.72、78.40±3.54和84.25±4.35U/mL(P<0.01)。以上結(jié)果表明,人參皂苷單體Rg1、Re和Rf對乙醇損傷肝細(xì)胞L-O2具有明顯的保護(hù)作用,清除乙醇代謝過程中產(chǎn)生的MDA以及提高抗氧化酶SO
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