cyclophilinA在單核細胞參與動脈粥樣硬化炎癥反應中的作用研究.pdf

1、動脈粥樣硬化性心腦血管疾病目前是威脅人類健康的頭號殺手。深入研究動脈粥樣硬化(AS)的基礎分子機制，尋找有效的抗動脈粥樣硬化靶點，一直是生命科學研究中最活躍的前沿領域之一。目前認為，AS是動脈壁對各種損傷過度表達的慢性炎癥過程。在此過程中，氧化應激(oxidative stress，OS)是細胞損傷的主要原因，活性氧(ROS)是動脈粥樣硬化血管炎癥的關鍵驅(qū)動因素，ROS激活并促進氧化應激瀑布鏈，形成惡性循環(huán)，加劇AS進程并誘發(fā)斑塊不穩(wěn)定

2、和破裂而發(fā)生嚴重臨床心血管事件。因此，阻斷氧化應激和炎癥過程，已成為當前抗動脈粥樣硬化研究的重要靶標。
　　 cyclophilinA(CyPA)為親環(huán)素家族成員之一，最近研究發(fā)現(xiàn)其在AS斑塊中高表達，是體內(nèi)對AS氧化應激和炎癥反應的主要活性氧誘導因子之一，在氧化應激條件下，CyPA的表達和分泌增加，并可由細胞內(nèi)分泌至細胞外，細胞分泌CyPA對心血管疾病的病理、生理起重要的調(diào)節(jié)作用，特別是AS發(fā)生、血管增殖及狹窄等。細胞外CyP

3、A增強AS進程中的主要炎癥細胞-單核/巨噬細胞的炎癥活動，但是CypA以何種方式與單核細胞/巨噬細胞相互作用，其中的作用機制以及相關調(diào)控還不清楚。
　　 在本課題中，我們以體外培養(yǎng)的人類單核細胞系THP-1細胞為研究對象，以體外人的重組cyclophilinA蛋白模擬氧化應激和炎癥反應產(chǎn)物作為刺激，擬從CypA誘導的單核細胞炎癥反應細胞模型中，探討細胞外CypA對單核細胞炎癥反應的作用結(jié)果、深層次的作用機制以及相關調(diào)控，擬為設計

4、和開發(fā)新的抗動脈粥樣硬化藥物靶點提供初步的理論和實驗依據(jù)。
　　 第一部分 cyclophilinA在單核細胞炎癥反應中的作用
　　 目的：探討cyclophilinA在單核細胞氧化應激炎癥反應中的相關作用。
　　 方法：人類單核細胞系THP-1細胞常規(guī)體外培養(yǎng)，以CypA作為氧化應激炎癥反應的主要活性氧誘導因子刺激，通過細胞遷移趨化實驗(Transwell)檢測CypA對單核細胞遷移趨化的影響；炎癥刺激后，酶聯(lián)

5、免疫吸附試驗(ELISA)法檢測單核細胞培養(yǎng)液中主要炎癥反應因子白介素6(IL-6)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量變化；明膠酶譜法測定基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性變化
　　 結(jié)果：(1)CypA作為炎癥刺激，可以誘導單核細胞的遷移趨化；(2)CypA(200ng/ml)誘導單核細胞分泌炎癥反應因子白介素6(IL-6)；(3)CypA(200ng/ml)增強單核細胞的基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性；(4)Cyp

6、A對單核細胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌沒有影響。
　　 結(jié)論：(1)CypA對單核細胞具有遷移趨化的作用；(2)CypA可以誘導單核細胞分泌炎癥反應因子白介素6(IL-6)，但是對腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌沒有影響；(3)CypA可以增強單核細胞基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性。
　　 第二部分 cyclophilinA對單核細胞的促炎癥反應與炎癥信號通路的關系
　　 目的：探討cycloph

7、ilinA對單核細胞炎癥反應中的幾種重要炎癥信號通路的影響；cyclophilinA是否通過某些重要炎癥信號通路調(diào)控炎癥反應因子的分泌。
　　 方法：人類單核細胞系THP-1細胞常規(guī)體外培養(yǎng)，以CypA作為氧化應激炎癥反應因子刺激，使用Western blotting方法檢測了NF-κB炎癥信號通路、MAPK炎癥信號通路(包括ERK，JNK，p-38信號通路)的表達和EMMPRIN蛋白的表達；使用ERK1/2通路抑制劑PD980

8、59預處理細胞后，Western blotting方法檢測了NF-κB炎癥信號通路表達、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測單核細胞培養(yǎng)液中炎癥反應因子白介素6(IL-6)含量、明膠酶譜法測定基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性變化。
　　 結(jié)果：(1)CypA能夠激活單核細胞NF-κB炎癥信號通路；(2)CypA能夠激活單核細胞MAPK(包括ERK，JNK，p-38信號通路)炎癥信號通路；(3)ERK1/2通路抑制劑PD980

9、59預處理細胞后，NF-κB炎癥信號通路的激活被抑制；(4)ERK1/2通路抑制劑PD98059預處理細胞后，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性被抑制；(5)ERK1/2通路抑制劑PD98059預處理細胞后，白介素6(IL-6)分泌沒有變化；(6)CypA對單核細胞EMMPRIN的表達沒有影響。
　　 結(jié)論：(1)CypA能夠激活單核細胞NF-κB炎癥信號通路；(2)CypA能夠激活單核細胞MAPK(包括ERK，JNK，p-3

10、8信號通路)炎癥信號通路；(3)CypA通過MAPK炎癥信號通路來激活NF-κB炎癥信號通路；(4)CypA通過MAPK-NF-κB炎癥信號通路增強MMP-9的活性。
　　 第三部分調(diào)控EMMPRIN對cyclophilinA在單核細胞促炎癥反應中的影響
　　 目的：探討EMMPRIN在cyclophilinA促單核細胞炎癥反應中的作用，調(diào)控EMMPRIN對cyclophilinA誘導的單核細胞遷移趨化、炎癥信號通路激活

11、和炎性細胞因子釋放的影響。
　　 方法：人類單核細胞系THP-1細胞常規(guī)體外培養(yǎng)。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，RNA干擾技術(shù)沉默EMMPRIN基因表達和/或使用EMMPRIN活性阻滯抗體阻斷EMMPRIN活性的方法干預處理細胞后，以CypA作為氧化應激炎癥反應因子刺激，細胞遷移趨化實驗(Transwell)檢測單核細胞的遷移趨化；使用Western blotting方法檢測NF-κB炎癥信號通路和MAPK炎癥信號通路(包括ERK，JNK，p

12、-38信號通路)的表達；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測白介素6(IL-6)表達；明膠酶譜法測定基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性。
　　 結(jié)果：(1)調(diào)控EMMPRIN能夠抑制CypA對單核細胞的遷移趨化作用；(2)調(diào)控EMMPRIN能夠抑制CypA對單核細胞NF-κB炎癥信號通路和MAPK(包括ERK，JNK，p-38信號通路)炎癥信號通路的激活；(3)調(diào)控EMMPRIN能夠抑制CypA誘導的單核細胞MMP-9的活性增