DC-SIGN適體抑制樹突狀細(xì)胞參與的動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng).pdf

1、全文分為三部分： 第一部分：同型半胱氨酸對樹突狀細(xì)胞黏附遷移及DC-SIGN表達(dá)的影響 [目的]：高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子,動脈粥樣硬化(artherosclerosis,AS)目前被認(rèn)為是一種炎癥和免疫性疾病.本研究通過觀察同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)對樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)表面黏附分子DC-SI

2、GN的表達(dá),及對DC與內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)、T淋巴細(xì)胞之間相互作用的影響,來探討AS形成的可能機(jī)制. [方法]： 1、各種細(xì)胞的分離和培養(yǎng):(1)用淋巴細(xì)胞分離液從健康成人外周血白細(xì)胞懸液分離單個(gè)核細(xì)胞,再用CD14<'+>磁珠分選出純度大于98﹪的CD14<'+>單核細(xì)胞,用含20ng/ml rhGM-CSF(recombinant human granulocyte macropha

3、ge-colonystimulating factor)、10ng/ml rhlL-4(recombinant human interleukin-4)、10﹪胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMl1640培養(yǎng)基培養(yǎng),第5天收集懸浮細(xì)胞作為未成熟DC(immature DC,imDC),加100 ng/ml的LPS繼續(xù)培養(yǎng)2天收集起來作為成熟DC(mature DC,mDC).(2)用0.1﹪I型膠原酶從健康

4、產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)臍帶消化獲得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelialcells,HUVECs),用含15﹪FBS,10 ng/ml rhEGF(recombinant human epidermalgrowth factor)的M199培養(yǎng)基培養(yǎng),用抗Ⅷ因子抗體鑒定呈陽性.(3)經(jīng)37℃的RPMI 1640培養(yǎng)基潤洗的尼龍毛柱,加入2×10<'7>/ml的外周血單個(gè)核細(xì)胞37℃孵育1 h,以1滴/s的

5、速度收集濾液及洗液,即得到T淋巴細(xì)胞,可用于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng). 2、細(xì)胞干預(yù):用0、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mmol/L的Hcy干預(yù)imDC或mDC 24 h.3、各種指標(biāo)的檢測:用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)及吞噬能力,用黏附和遷移試驗(yàn)檢測未成熟DC對EC黏附和遷移的能力,用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測成熟DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力,用Western blot和免疫熒光染色檢測DC表面DC-SIGN蛋白的

6、表達(dá). [結(jié)論]： 1、Hcy并不刺激DC成熟、分化及吞噬能力的改變; 2、病理生理濃度的Hcy可一定程度的刺激mDC誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖; 3、病理生理濃度的Hcy促進(jìn)imDC與EC的黏附; 4、病理生理濃度的Hcy促進(jìn)imDC遷移穿過內(nèi)皮. 5、病理生理濃度的Hcy促進(jìn)DC表面DC-SIGN的表達(dá). 第二部分：DC-SIGN特異性適體的篩選 [目的]：樹突狀細(xì)胞(de

7、ndritic cells,DCs)是體內(nèi)最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs),DC-SIGN是DC表面一種新型的凝集素受體.本研究以DC-SIGN蛋白為靶分子,利用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)從隨機(jī)ssDNA文庫中篩選與DC-SIGN特異結(jié)合的寡核苷酸適配子,即

8、適體(aptamer),并對所篩選出的適體進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的初步分析,為感染、腫瘤以及動脈粥樣硬化的基因治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù). [方法]： 1、構(gòu)建長度為79 nt的隨機(jī)ssDNA文庫,兩端為固定序列,中間35個(gè)核苷酸為隨機(jī)序列:5'-CGGGGATCCGGAATTCTCCTCACA-N35-GTAFGTCGACGAAGCTTGCG-3'.合成上游引物:5'-CGGGGATCCGGAATTTCCTCACA-3',下游5'

9、標(biāo)記生物素引物:5'-Bio-CGCAAGCTTCGTCGACATAC-3'. 2、把DC-SIGN蛋白包被于96孔酶聯(lián)板上,先反篩去與BSA結(jié)合的非特異ssDNA,使不與BSA結(jié)合的ssDNA與DC-SIGN結(jié)合,然后把它們從酶聯(lián)板上洗脫下來,用PCR擴(kuò)增成一端帶生物素的dsDNA,用鏈親和素磁珠分離得到可用于下一輪篩選的ssDNA. 3、篩選得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化、克隆、測序. 4、測定適體與DC-SIGN蛋白

10、結(jié)合的親和力及解離常數(shù). [結(jié)論] ： 1、本研究利用sEIrEX技術(shù)從隨機(jī)ssDNA文庫中篩選出DC-sIGN的特異性寡核苷酸適體. 2、對適體進(jìn)行純化、克隆和測序得到它們的一級結(jié)構(gòu). 3、第16條適體與DC-SIGN蛋白結(jié)合的親和力較高K<,d>值為21.73 nmol/L,其序列為:GGCGAAAATTTGTGGATATAGAGGGTTACTCGGAT. 第三部分：DC-SIGN特異性適體對

11、樹突狀細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞之間相互作用的影響 [目的]： 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是體內(nèi)最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞,DC-SIGN是DC表面一種新型的凝集素受體.我們已經(jīng)利用指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)從隨機(jī)ssDNA 文庫中篩選得到與DC-SIGN特異結(jié)合的寡核苷

12、酸適配子,即適體(aptamer).本研究將觀察該適體對DC與內(nèi)皮細(xì)胞 (endothelial cells,ECs)、T淋巴細(xì)胞之間相互作用的影響,為抗感染、抗腫瘤及動脈粥樣硬化的基因治療進(jìn)一步提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù). [方法]： 1、各種細(xì)胞的分離和培養(yǎng):(1)用淋巴細(xì)胞分離液從健康成人外周血白細(xì)胞懸液分離單個(gè)核細(xì)胞,再用CD14<'+>磁珠分選出純度大于98﹪的CD14<'+>單核細(xì)胞,用含20 ng/ml rhGM

13、-CSF、10 ng/ml rhIL-4、10﹪FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),第5天收集懸浮細(xì)胞作為未成熟DC(immature DC,imDC),加100 ng/ml的LPS繼續(xù)培養(yǎng)2天收集起來作為成熟DC(mature DC,mDC).(2)用0.1﹪I型膠原酶從健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)臍帶消化獲得 HUVECs,用含15﹪FBS,10 ng/mlrhEGF的M199培養(yǎng)基培養(yǎng),用抗Ⅷ因子抗體鑒定呈陽性.(3)經(jīng)37℃的RPMI1640

14、培養(yǎng)基潤洗的尼龍毛柱,加入2×10<'7>/ml的外周血單個(gè)核細(xì)胞37℃孵育1 h,以1滴/s的速度收集濾液及洗液,即得到T淋巴細(xì)胞,可用于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng). 2、DC的實(shí)驗(yàn)分組:(1)空白對照組;(2)0.5 mmol/LHcy組;(3)抗DC-SIGN抗體組; (4)0.5 mmol/LHcy+抗DC-SIGN抗體組; (5) DC-SIGN適體組;(6)0.5 mmol/L Hcy+DC-SIGN適體組. 3、各