自發(fā)性高血壓大鼠腎臟組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究及氯沙坦對(duì)其的影響.pdf

1、高血壓病是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害著人類的健康。據(jù)估計(jì)世界范圍內(nèi)約有25％的成人患有此病，我國(guó)目前大約有1億多高血壓患者，而且高血壓的發(fā)病率還在逐年增加之中。大量流行病學(xué)和臨床實(shí)驗(yàn)都已證明高血壓是大多數(shù)心血管疾病、腎臟疾病和周圍血管疾病的重要致病原因。高血壓已成為全球共同面臨的主要公共健康問(wèn)題之一。腎臟既是體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓的重要器官，同時(shí)又是高血壓損害的主要靶器官之一。腎功能的受損將進(jìn)一步惡化高血壓的發(fā)展。近年來(lái)研究認(rèn)為腎素一血管緊張素

2、一醛固酮系統(tǒng)(RAS)的激活可能在高血壓性腎損害中起著重要的作用。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)是RAS中重要的活性物質(zhì)，可以刺激多種蛋白質(zhì)分子(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，骨橋蛋白等)的表達(dá)增加，進(jìn)而引起腎臟的損害。氯沙坦是臨床上廣泛應(yīng)用的一種Ang Ⅱ受體拮抗劑，其降壓，保護(hù)腎臟的作用已為大量臨床試驗(yàn)所證實(shí)，然而其腎臟保護(hù)作用的確切機(jī)制仍未明了。 盡管人類基因組計(jì)劃已經(jīng)完成，然而依靠基因水平的分析有時(shí)并不足以了解疾病發(fā)生的機(jī)制，大部分疾病的發(fā)

3、生與蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)。對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的研究才是揭示生命活動(dòng)和疾病機(jī)制的最終階段，由此在基因組學(xué)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了蛋白質(zhì)組學(xué)這門(mén)新興學(xué)科。蛋白質(zhì)組是指一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)組學(xué)則是應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門(mén)學(xué)科。其 目的 是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。雙向凝膠電泳以及質(zhì)譜分析是蛋

4、白質(zhì)組研究中的主要技術(shù)，可同時(shí)分離成百上千種蛋白質(zhì)并進(jìn)行鑒定。盡管蛋白質(zhì)組學(xué)的提出迄今不過(guò)十來(lái)年時(shí)間，卻發(fā)展迅速，己廣泛深入到生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，在發(fā)現(xiàn)疾病的標(biāo)志分子，闡明疾病的分子機(jī)制，研究藥物新靶點(diǎn)等方面有著廣泛的應(yīng)用。通過(guò)比較正常、高血壓時(shí)以及抗高血壓藥物治療后腎臟組織蛋白質(zhì)在表達(dá)數(shù)量、表達(dá)位置和修飾狀態(tài)上的差異，有可能發(fā)現(xiàn)與高血壓性腎臟損害相關(guān)的特異蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)既可為高血壓性腎損傷的發(fā)病機(jī)制提供線索，也可作為疾病診斷的分子

5、標(biāo)志，還可作為治療和藥物開(kāi)發(fā)的靶標(biāo)，具有重要的理論和實(shí)際意義。 本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓大鼠為研究對(duì)象，選取雄性6周齡的Wistar Kyoto大鼠6只和同周齡的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)12只，SHR又隨機(jī)分為高血壓組及高血壓藥物干預(yù)組(Losartan組)。降壓藥物氯沙坦溶于水中，按每只大鼠20mg／kg／day的劑量喂給，根據(jù)大鼠體重，每周調(diào)整藥物劑量一次。每周測(cè)量大鼠血壓、體重。8周后處死大鼠取腎臟組織，提取組織蛋白。另取部

6、分腎組織HE染色，用于觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化。蛋白濃度采用Bradford法測(cè)定。取蛋白樣品200μg進(jìn)行雙向凝膠電泳，凝膠用硝酸銀進(jìn)行染色，銀染的凝膠掃描后用Imagemaster 2D v5.0軟件進(jìn)行分析，將分析發(fā)現(xiàn)的差異蛋白點(diǎn)切下，酶解消化，取消化后的多肽混合物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，將所得的肽質(zhì)量指紋圖譜輸入到Mascot軟件中搜索NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)以確定蛋白質(zhì)的歸屬。并對(duì)鑒定出的蛋白質(zhì)用western blot方法進(jìn)行證實(shí)。

7、 結(jié)果： (1)6周時(shí)，與WKY相比，SHR大鼠的血壓已明顯升高(150.72±5.07 VS 110.11±3.74，p＜0.01)，隨著周齡的增加，SHR大鼠的血壓也隨之增加，而WKY大鼠血壓無(wú)明顯變化。給予氯沙坦治療兩周后，SHR大鼠血壓已明顯降低(162.33±8.86 vS 142.22±13.40，p＜0.05)，連續(xù)應(yīng)用8周，降壓作用明顯而穩(wěn)定。 (2)14周齡時(shí)，SHR大鼠腎小動(dòng)脈已可見(jiàn)病理上的改變

8、，動(dòng)脈血管管壁增厚，管腔變窄；給予氯沙坦治療8周后，腎小動(dòng)脈血管管壁增厚的程度有所減輕。 (3)對(duì)蛋白樣品進(jìn)行雙向凝膠電泳，染色，成功建立了正常、高血壓及氯沙坦干預(yù)后大鼠腎臟組織的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。三組凝膠檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)分別為1144±35、1215±78、1219±44。與WKY組相比較，SHR組腎臟表達(dá)有差異的蛋白有25個(gè)，其中表達(dá)增強(qiáng)的蛋白點(diǎn)有9個(gè)(2，3，5，6，13，14，15，17和22號(hào)點(diǎn))，表達(dá)降低的蛋白點(diǎn)有6個(gè)(

9、16，18，20，23，24和25號(hào)點(diǎn))，新出現(xiàn)的蛋白點(diǎn)有10個(gè)(1，4，7，8，9，10，11，12，19和21號(hào)點(diǎn))。將這些點(diǎn)切下后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，11個(gè)點(diǎn)得到了鑒定。與WKY相比，SHR大鼠腎臟蛋白表達(dá)上調(diào)的點(diǎn)有5個(gè):laminin gamma 2 chain precursor(spot 2，22)，Tcrb protein(spot 5)，Aldo-keto reductase family 1 member A l(spot

10、6)和ribosomal protein S2(spot 12)；表達(dá)降低的點(diǎn)有2個(gè)：Hypothetical protein LOC361596(spot 18)and R／KEN cDNA 2700081015(spot 24)；新出現(xiàn)的點(diǎn)有4個(gè)：BC030314 protein(spot 1)，eno 1 protein(spot 4)，laminin gamma 2 chain precursor(spot 8)and phos

11、phatidylinositol transfer protein beta(spot 19)。使用氯沙坦治療后，SHR大鼠腎臟6個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)降低：分別是BC030314 protein(spot 1)，enol protein(spot 4)，Aldo-keto reductase family 1(spot 6)，laminin gamma 2 chain precursor(spot 8)and phosphatidylinosi

12、tol transfer protein beta(spot 1 9)，laminin gamma 2 chain precursor(spot 19)；Hypothetical protein LOC361596(spot 18)和R／KEN cDNA 2700081015(spot 24)表達(dá)增加；另3個(gè)點(diǎn)laminin gamma 2 chain precursor(spot 2)，Tcrb protein(spot 5)和rib

13、osomal protein S2(spot 12)的表達(dá)無(wú)明顯改變。 (4)spot 2，8和22點(diǎn)被鑒定為同一個(gè)蛋白laminin gamma 2 chain precursor。 (5)銀染法進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的成功率為44％。 (6)采用Western blot方法對(duì)4號(hào)點(diǎn)(Enol protein)及18號(hào)點(diǎn)(Hypothetical protein LOC361596，也即是NADP+-ICDH)的檢測(cè)表明

14、：Enol protein在SHR大鼠腎臟中表達(dá)明顯升高，氯沙坦治療后該蛋白表達(dá)明顯降低；NADP+-ICDH在高血壓組表達(dá)明顯降低，藥物干預(yù)后表達(dá)增加，與雙向電泳結(jié)果相一致。 結(jié)論： (1)6周齡時(shí)SHR大鼠的血壓已明顯升高，隨著周齡的增加，SHR大鼠的血壓也隨之增加，14周齡時(shí)SHR大鼠腎小動(dòng)脈已可見(jiàn)病理上的改變，SHR大鼠可用于高血壓腎臟損害的研究。 (2)氯沙坦治療兩周后，SHR大鼠血壓已明顯降低，持續(xù)給

15、藥，降壓作用明顯而穩(wěn)定。 (3)與WKY大鼠相比，高血壓大鼠腎臟組織中有25個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了明顯的改變。其中有11個(gè)蛋白點(diǎn)得到了鑒定，部分蛋白點(diǎn)的表達(dá)能被氯沙坦逆轉(zhuǎn)。這些蛋白質(zhì)涉及到能量代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞增生等過(guò)程，這些蛋白質(zhì)可作為進(jìn)一步研究高血壓性腎損害的靶點(diǎn)。 (4)膠上不同位置的點(diǎn)被鑒定為同一個(gè)蛋白，可能與該蛋白存在異構(gòu)體或在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中被降解有關(guān)。 (5)銀染法用于質(zhì)譜鑒定的成功率較低，更為靈敏而有效