口服Ag85A DNA疫苗在小鼠腸道局部的表達(dá).pdf

1、自從1997年Jones和Pascual等人分別用PLG(poly-DL-lactide-co-glycolide)微粒和減毒傷寒桿菌(Salmonilla typhimurium)為運(yùn)載體(vectors)制備口服DNA疫苗以來，已經(jīng)有多篇報(bào)道對口服DNA疫苗在預(yù)防或治療感染、腫瘤和過敏性疾病中的作用進(jìn)行了研究，并取得了較好的效果。但口服DNA疫苗在腸黏膜的表達(dá)部位及細(xì)胞尚不清楚。 腸道黏膜表面是大多數(shù)致病菌進(jìn)人機(jī)體的主要通道

2、。接種黏膜疫苗以激發(fā)免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化是抗感染的主要手段之一。腸黏膜免疫系統(tǒng)中參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞遍布于腸黏膜內(nèi)，其中M細(xì)胞是回腸派氏淋巴結(jié)(Peyer’s patch，PP)表面濾泡相關(guān)上皮(follicle-associated epithelium，F(xiàn)AE)中的一種特殊的上皮細(xì)胞，存在于淋巴濾泡上皮之間，與腸上皮細(xì)胞緊密排列在一起，形成上皮屏障，并與其“口袋”中的各種淋巴細(xì)胞緊密接觸。腸腔中的大部分病原體是由M細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至其下的免疫細(xì)

3、胞，從而引起局部的黏膜免疫反應(yīng)，乃至系統(tǒng)免疫反應(yīng)。由此可見，M細(xì)胞在腸道黏膜免疫反應(yīng)中起著非常重要的作用。腸上皮細(xì)胞形成規(guī)則的微絨毛，而M細(xì)胞形成不規(guī)則的微皺褶，因此又稱作微皺褶細(xì)胞(Microfold cel1)。M細(xì)胞呈圓頂狀，細(xì)胞基底部向頂部(腸腔面)深陷，形成一中央腔。M細(xì)胞的中央腔很大，含有豐富的淋巴細(xì)胞，其頂部及周邊胞質(zhì)很薄，胞質(zhì)中含有大量的吞飲小泡，M細(xì)胞的基底膜常常是不連續(xù)的，可允許淋巴細(xì)胞自由穿過。M細(xì)胞的這些特殊結(jié)構(gòu)

4、及定位大大縮短了含有抗原或病原微生物的吞飲小泡跨越M細(xì)胞的距離，有利于抗原快速進(jìn)人上皮下淋巴組織。目前的研究表明，小腸絨毛上皮M細(xì)胞是攝取腸道細(xì)菌的重要途徑，還有報(bào)道小腸黏膜內(nèi)DC可以攝取抗原物質(zhì)。 抗原85復(fù)合體(Ag85)是BCG合成的能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫的多種成分之一，國外已有研究者將其試用于免疫生物治療。比利時(shí)布魯塞爾巴斯德研究所Huygen研究組多年來在對Ag85進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，接種Ag85蛋白主要引起

5、機(jī)體細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，他們還觀察到攜帶Ag85基因的的質(zhì)粒DNA疫苗具有：(1)經(jīng)肌肉注射給動物(小鼠)，主要引起Th1樣的應(yīng)答，產(chǎn)生IL-2、IFN-γ和TNF-α，經(jīng)基因槍注射則主要產(chǎn)生Th2應(yīng)答和抗體產(chǎn)生水平增加；(2)肌肉注射治療膀胱癌，近80％的病人外周血和脾臟中T淋巴細(xì)胞增殖，產(chǎn)生IL-2和IFN-γ的量增加，未見明顯的Th2細(xì)胞活化和抗體產(chǎn)生增加；(3)可誘導(dǎo)長壽命的T細(xì)胞產(chǎn)生；(4)可降低遲發(fā)型超敏反應(yīng)的強(qiáng)度。裸DNA疫

6、苗經(jīng)肌肉注射，其目的基因一般在肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，但經(jīng)口服DNA疫苗在消化道細(xì)胞內(nèi)表達(dá)定位目前尚無報(bào)道。 到目前為止，已有的一些研究表明口服DNA疫苗能誘導(dǎo)全身性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答增強(qiáng)。我們在近期的初步實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)口服DNA疫苗進(jìn)入腸道后，在腸黏膜吸收過程中將對IEL產(chǎn)生效應(yīng)作用，促進(jìn)黏膜免疫功能增強(qiáng)，有益于衰老和感染的上皮細(xì)胞的清除與更新，保持黏膜局部結(jié)構(gòu)和功能的完整性。同時(shí)，有關(guān)其是否產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)也有待進(jìn)一步研

7、究。我們推論口服DNA疫苗所產(chǎn)生的全身性免疫效應(yīng)實(shí)際是腸道局部黏膜免疫應(yīng)答后的一系列反應(yīng)。 在上述研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)檢測了Ag85A基因的表達(dá)產(chǎn)物在腸道局部黏膜上皮細(xì)胞、M細(xì)胞和DC中的分布，為闡明口服DNA疫苗誘導(dǎo)腸道局部黏膜免疫反應(yīng)的機(jī)制及臨床經(jīng)口接種DNA疫苗提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料和方法： 一、實(shí)驗(yàn)動物：6～8周齡雌性C57BL/6小鼠。 二、主要試劑：自制DNA疫苗pCDNA3.1+/A

8、g85A：Lipofectamine TM2000，chicken anti-Ag85A IgY，HRP-goat-anti-chicken IgY，F(xiàn)ITC-goat-anti-chicken IgY，Purified Armenian Hamster-anti-mouse CD11c，Texas Red conjugated Goat Anti-Armenian Hamster IgG，TRITC conjugated UEA-1，

9、無內(nèi)毒素型超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒，BSA，DAB顯色試劑盒。 三、實(shí)驗(yàn)方法：應(yīng)用基因工程技術(shù)擴(kuò)增全長Ag85A基因序列，經(jīng)測序和同源性分析后將其亞克隆入真核表達(dá)載體pCDNA3.1+，鑒定正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，擴(kuò)增抽提無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒，進(jìn)一步用脂質(zhì)體包裹制成口服重組DNA疫苗。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組，即生理鹽水組和脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒組。分別將生理鹽水和脂質(zhì)體包裹pCDNA3.1+-Ag85A以灌

10、胃方式投給各組小鼠，共免疫3次，每次間隔14天，末次免疫后14天處死小鼠，取腸，免疫組化、免疫熒光檢測Ag85A在腸黏膜上皮細(xì)胞、派氏淋巴結(jié)、腸道局部M細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的表達(dá)情況。 結(jié)果： Ag85A重組DNA疫苗在小鼠腸道局部黏膜上皮細(xì)胞、M細(xì)胞及派氏淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞均有表達(dá)。Ag85A在靠近小鼠小腸黏膜固有層的上皮細(xì)胞中表達(dá)的強(qiáng)度比靠近腸腔側(cè)的上皮細(xì)胞表達(dá)的強(qiáng)度高，Ag85A在小鼠小腸黏膜M細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)度非常高。

11、 討論 腸道是接觸抗原物質(zhì)最多的器官，腸道相關(guān)淋巴組織主要包括派氏淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)，然而，腸道內(nèi)發(fā)揮免疫效應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞并不僅限于此，而是遍布于腸黏膜內(nèi)。M細(xì)胞是攝取腸道內(nèi)抗原物質(zhì)的主要細(xì)胞，分布于小腸派氏淋巴結(jié)和絨毛上皮。目前的研究表明，小腸絨毛上皮M細(xì)胞是攝取腸道細(xì)菌的重要途徑，還有報(bào)道小腸黏膜內(nèi)DC可以攝取抗原物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明，M細(xì)胞還可以攝取質(zhì)脂體包裹的DNA疫苗，而在小腸黏膜內(nèi)DC中未見到DNA疫苗的表達(dá)。

12、 DC是專職抗原提呈細(xì)胞，其主要功能是攝取、加工處理和提呈抗原。DC包括成熟和未成熟兩種形式，未成熟的DC主要分布在非淋巴器官和血液中，發(fā)揮哨兵作用。當(dāng)病原體進(jìn)入時(shí)，未成熟的DC能夠攝取并將其提呈給吞噬細(xì)胞。未成熟DC攝取、加工處理抗原能力強(qiáng)，而提呈抗原激發(fā)免疫應(yīng)答能力弱，成熟DC攝取、加工處理抗原能力弱，而提呈抗原、啟動免疫應(yīng)答能力強(qiáng)。我們在實(shí)驗(yàn)中未見到小腸黏膜內(nèi)DC表達(dá)DNA疫苗編碼的蛋白，而在派氏淋巴結(jié)內(nèi)部分DC中觀察到了DNA疫