人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生長(zhǎng)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體構(gòu)成牙齒的主體，是組織工程化牙齒構(gòu)建的關(guān)鍵。因此，牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體的建立將是今后組織工程牙研究的重點(diǎn)。本研究根據(jù)組織工程學(xué)的理論和方法，對(duì)構(gòu)建組織工程化牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體的種子細(xì)胞、支架材料等問題進(jìn)行了系統(tǒng)性地研究，以期為牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線。 本試驗(yàn)的目的為：1、體外分離培養(yǎng)人牙乳頭間充質(zhì)細(xì)胞(Humandentalpapillamesenchymalcells，hDPMCs)

2、，研究其細(xì)胞生物學(xué)性狀，為下一步的研究提供細(xì)胞來源。2、探討生長(zhǎng)因子bFGF和IGF-Ⅰ對(duì)體外培養(yǎng)的hDPMCs增殖和分化的影響。3、探討hDPMCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞的定向分化機(jī)制。4、制備新型組織工程牙生物可降解支架材料，探討hDPMCs與可降解泡末支架材料復(fù)合生長(zhǎng)情況，為構(gòu)建組織工程化牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)方法。 本試驗(yàn)的方法為：1、選擇3～4月胎齡的自然流產(chǎn)人胚胎，解剖牙乳頭，組織塊法培養(yǎng)hDPMCs，用波形絲

3、蛋白和細(xì)胞角蛋白雙重染色鑒定細(xì)胞；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的體外生長(zhǎng)特點(diǎn)；通過Ⅰ型膠原、纖維粘連蛋白和層粘連蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色，對(duì)細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下的基質(zhì)形成能力進(jìn)行研究；通過茜素紅染色對(duì)細(xì)胞的礦化能力進(jìn)行研究。2、采用四唑藍(lán)比色法觀察IGF-Ⅰ3和bFGF的不同濃度和不同作用時(shí)間對(duì)hDPMCs增殖的影響；采用改良酶動(dòng)力學(xué)法觀察IGF-Ⅰ和bFGF的不同作用濃度和不同作用時(shí)間對(duì)hDPMCs的ALP活性的影響。3、用100μg/L濃度的IG

4、F-Ⅰ或10μg/L濃度的bFGF作用于hDPMCs，采用倒置顯微鏡、酶化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR等方法從形態(tài)學(xué)和功能學(xué)方面檢測(cè)細(xì)胞的變化，探索hDPMCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的機(jī)制。4、以DL-乳酸為原料采用溶液澆鑄—顆粒濾除法制備多孔PDLLA生物泡沫支架材料；用SEM、液體替代法等對(duì)材料的孔隙狀況進(jìn)行測(cè)定，對(duì)材料的力學(xué)和降解性等進(jìn)行研究；將細(xì)胞與PDLLA泡沫支架進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，用倒置顯微鏡、掃描電鏡、流式細(xì)胞儀等檢測(cè)細(xì)胞在材料

5、表面的生長(zhǎng)增殖狀況；將細(xì)胞—支架復(fù)合體植入裸鼠背部皮下，術(shù)后4、8、16周處死裸鼠，取出植入體，用HE染色、Masson染色及DSPP免疫組織化學(xué)染色等方法觀察新生組織的牙向分化情況。 本試驗(yàn)的結(jié)果為：1、用組織塊法培養(yǎng)的hDPMCs在體外生長(zhǎng)良好，細(xì)胞呈梭形、三角形或多角形；細(xì)胞及分泌基質(zhì)中的Ⅰ型膠原、纖維粘連蛋白和層粘連蛋白表達(dá)陽(yáng)性，說明細(xì)胞具有形成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力；礦化誘導(dǎo)細(xì)胞可形成礦化結(jié)節(jié)，說明細(xì)胞具有形成鈣化基質(zhì)

6、的能力。2、在0～100μg/L范圍內(nèi)，bFGF和IGF-Ⅰ對(duì)hDPMCs增殖具有促進(jìn)作用，bFGF的促增殖作用比IGF-Ⅰ大，兩種因子聯(lián)合作用時(shí)有協(xié)同作用；bFGF的最大有效濃度為10μg/L，IGF-Ⅰ的最大作用濃度為100μg/L。在0～7d培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，bFGF對(duì)hDPMCs的ALP活性增加不明顯，IGF-Ⅰ對(duì)ALP活性隨時(shí)間的增加而顯著增加，bFGF與IGF-Ⅰ對(duì)增加ALP的活性有協(xié)同作用。3、IGF-Ⅰ組和IGF-Ⅰ+bFGF

7、組刺激的hDPMCs，7d后在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞出現(xiàn)單一細(xì)胞漿突起，形態(tài)似成牙本質(zhì)樣細(xì)胞；細(xì)胞的DSPP免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽(yáng)性表達(dá)；RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞表達(dá)人成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志hDSPPmRNA。4、制備的PDLLA支架泡沫材料外觀呈乳白色；材料表面孔隙密布，孔隙間相互通連，微孔孔4徑為100～300μm，在大孔的孔壁上有許多微孔；材料孔隙率達(dá)90％左右；12周時(shí)的降解率達(dá)52％。細(xì)胞與PDLLA泡沫支架材料體外復(fù)合培養(yǎng)6h，

8、倒置顯微鏡可見材料周邊和孔隙邊緣有較多的細(xì)胞附著，隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞增多；掃描電鏡觀察培養(yǎng)1d后細(xì)胞附著于材料表面，呈梭形、三角形或多角形，細(xì)胞跨越微孔表面或長(zhǎng)入微孔，培養(yǎng)8d后細(xì)胞密集生長(zhǎng)，接觸緊密，部分區(qū)域有基質(zhì)形成，部分細(xì)胞有單一胞漿突起；細(xì)胞在體外與材料復(fù)合生長(zhǎng)后，細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明該細(xì)胞與原代細(xì)胞無(wú)差異，說明細(xì)胞在材料上生長(zhǎng)時(shí)，其增殖活動(dòng)未受材料影響。細(xì)胞—支架復(fù)合體植入體內(nèi)1周時(shí)，裸鼠創(chuàng)口Ⅰ期愈合；4

9、周取出標(biāo)本體積與植入時(shí)接近；8周與16周時(shí)取出的標(biāo)本體積較4周時(shí)明顯縮小，光澤度低，8周時(shí)可見有豐富的血管向植入物內(nèi)長(zhǎng)入。8周時(shí)和16周時(shí)可見材料區(qū)有X線阻射影。HE染色見：植入4周時(shí)材料部分吸收，大量細(xì)胞長(zhǎng)入材料間隙內(nèi)，有少量血管長(zhǎng)入；8周時(shí)，材料進(jìn)一步吸收，細(xì)胞及基質(zhì)成分更多，可見較豐富的血管長(zhǎng)入；16周時(shí)，細(xì)胞及基質(zhì)成分進(jìn)一步增多，仍見少量材料未吸收。Masson染色見：植入4周時(shí)細(xì)胞基質(zhì)中有少量的膠原形成，未見硬組織形成；8周時(shí)

10、可見豐富的血管和較多膠原，有少量硬組織形成；16周時(shí)可見豐富的膠原和硬組織形成。DSPP的免疫組化染色：植入4周時(shí)形成的部分基質(zhì)和細(xì)胞呈陽(yáng)性染色；8周時(shí)基質(zhì)和細(xì)胞成分增多，陽(yáng)性染色的細(xì)胞和基質(zhì)增多，表達(dá)增強(qiáng)；16周時(shí)陽(yáng)性染色的細(xì)胞和基質(zhì)成分進(jìn)一步增多，表達(dá)更強(qiáng)。 本試驗(yàn)的結(jié)論為：1、通過機(jī)械分離及貼壁法可獲得高純度的hDPMCs；hDPMCs有作為構(gòu)建牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體的種子細(xì)胞的應(yīng)用前景。2、IGF-Ⅰ、bFGF對(duì)hDPMCs

11、的生長(zhǎng)分化有重要調(diào)節(jié)作用；IGF-Ⅰ能誘導(dǎo)hDPMCs向功能性成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化；bFGF對(duì)IGF-Ⅰ有協(xié)同作用。3、PDLLA泡末支架材料具備良好的理化性能；材料與hDPMCs有較好的生物相容性；hDPMCs與材料復(fù)合體植入裸鼠體內(nèi)，可形成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，DSPP染色表達(dá)陽(yáng)性。 5綜上所述，本研究在體外成功分離培養(yǎng)hDPMCs的基礎(chǔ)上，應(yīng)用形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)及掃描電鏡等方法對(duì)hDPMCs的生物學(xué)性狀、向成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化以及細(xì)