藤黃酸聯(lián)合常用化療藥物對人胃腸腫瘤細(xì)胞株的作用及機(jī)制探討.pdf

1、目的：探討藤黃酸(Gambogic acid，GA)聯(lián)合常用化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、奧沙利鉑(Oxaliplatin，Oxa)、多西紫杉醇(Docetaxel，Doc)體外對人胃癌細(xì)胞株BGC.823、MKN-28和人大腸癌細(xì)胞株LOVO、SW-116生長的影響及可能機(jī)制。
　　 方法：1、采用MTT法檢測并確定GA、5-FU、Oxa、Doc單藥作用于指數(shù)增殖期人胃癌細(xì)胞株BGC-823、

2、MKN-28和人大腸癌細(xì)胞株LOVO、SW-116的IC50；2、依據(jù)單藥作用下的IC50，確定聯(lián)合用藥濃度梯度，GA分別聯(lián)合5-FU、Oxa或Doc作用于上述4株腫瘤細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測聯(lián)合用藥對腫瘤細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)；3、應(yīng)用中效原理(Median-effect Principle，Chou- Talalay聯(lián)合指數(shù)法)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制單藥及聯(lián)合用藥對腫瘤細(xì)胞生長的劑量-效應(yīng)曲線，確定聯(lián)合用藥時(shí)對腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)(Fa)與合用指數(shù)

3、(CI)的關(guān)系，判定藥物間的相互作用；4、對于在較低濃度下合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的腫瘤細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測GA聯(lián)合3種化療藥物對其凋亡的影響；5、應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測GA對4株腫瘤細(xì)胞細(xì)胞增殖周期的影響；6、應(yīng)用RT-PCR檢測比較兩組之間療效相關(guān)基因或凋亡抑制基因的表達(dá)差異，觀察GA對5-FU、奧沙利鉑、多西紫杉醇藥物療效相關(guān)基因影響及對腫瘤細(xì)胞凋亡抑制基因的影響。從而推斷GA與化療藥物間相互作用的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　

4、　 1、BGC-823細(xì)胞株：4種藥物單藥作用于指數(shù)增殖期的BGC-823細(xì)胞，48小時(shí)的IC50值分別為：GA2.332±0.046μM，5-FU332.807±97.366μM，Oxa10.501±2.735μM，Doc4.933±0.567μM.GA聯(lián)合5-FU作用于指數(shù)增殖期BGC-823細(xì)胞，當(dāng)Fa>0.25，CI<1，兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)；GA聯(lián)合Oxa作用于指數(shù)增殖期BGC-823細(xì)胞，當(dāng)Fa>0.10，CI<1，兩藥合

5、用效應(yīng)協(xié)同；GA聯(lián)合Doc作用于指數(shù)增殖期BGC-823細(xì)胞，當(dāng)Fa>0.15，CI<1，兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。細(xì)胞凋亡檢測也證實(shí)GA聯(lián)合5-FU、Oxa、Doc均可產(chǎn)生協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
　　 2、MKN-28細(xì)胞株：4種藥物單藥作用于指數(shù)增殖期的MKN-28細(xì)胞，48小時(shí)的IC50值分別為：GA1.662±0.112μM，5-FU18.844±1.969μM，Oxa15.141±1.188μM，Doc8.627±1

6、.900μM.GA聯(lián)合5-FU或Oxa作用于指數(shù)增殖期MKN-28細(xì)胞，當(dāng)Fa>0.5，兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，CI<1；GA聯(lián)合Doc作用于指數(shù)增殖期MKN-28細(xì)胞，無論在高濃度還是較低濃度用藥，均產(chǎn)生較好的協(xié)同效應(yīng)，CI均<1.應(yīng)用較低濃度的GA聯(lián)合Doc作用于MKN-28細(xì)胞，也證實(shí)GA聯(lián)合Doc，聯(lián)合組Annexin V+/PI-(早期凋亡)及Annexin V+/PI+(晚期凋亡或壞死細(xì)胞)所占比例明顯增多。
　　 3

7、、LOVO細(xì)胞株：4種藥物單藥作用于指數(shù)增殖期的LOVO細(xì)胞，48小時(shí)的IC50值分另q為：GA1.207±0.106μM，5-FU8.325±0.912μM，Oxa1.818±0.184μM，Doc4.491±0.735μM。GA聯(lián)合5-FU或Oxa作用于指數(shù)增殖期LOVO細(xì)胞，當(dāng)Fa>0.55，CI<1，兩藥聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)；GA聯(lián)合Doc作用于指數(shù)增殖期LOVO細(xì)胞，當(dāng)Fa>0.25，CI<1，兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，取1.0μM的

8、GA，2.5μM的Doc，單藥或聯(lián)合應(yīng)用作用于LOVO細(xì)胞，48hr后行細(xì)胞凋亡檢測，也證實(shí)GA聯(lián)合Doc，聯(lián)合組Annexin V+/PI-(早期凋亡)和Annexin V+/PI+(晚期凋亡或壞死細(xì)胞)所占比例明顯增多。
　　 4、SW-116細(xì)胞株：4種藥物單藥作用于指數(shù)增殖期的SW-116細(xì)胞，48小時(shí)的IC50值分別為：GA2.135±0.327μM，5-FU35.230±5.749μM，Oxa4.063±0.453μ

9、M，Doc1.774±0.434μM.GA聯(lián)合5-FU作用于指數(shù)增殖期SW-116細(xì)胞，當(dāng)Fa>0.55，即較大藥物劑量合用時(shí)，兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，CI<1；GA聯(lián)合Oxa作用于指數(shù)增殖期SW-116細(xì)胞，無論是較大藥物劑量聯(lián)合使用，抑或是較低劑量聯(lián)合，兩藥合用均只產(chǎn)生拮抗效應(yīng)。GA聯(lián)合Doc作用于指數(shù)增殖期SW-116細(xì)胞，當(dāng)Fa>0.4，兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，CI<1.應(yīng)用1.0μM的GA，2.5μM的Doc，單藥或朕合作用于SW

10、-116細(xì)胞，48br后行細(xì)胞凋亡檢測，也證實(shí)GA聯(lián)合Doc，聯(lián)合組Annexin V+/PI-(早期凋亡)和/或Annexin V+/PI+(晚期凋亡或壞死細(xì)胞)所占比例明顯增多。
　　 5、GA對四種腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞增殖周期的影響：GA作用于BGC-823細(xì)胞48hr，細(xì)胞發(fā)生明顯的G2/M期阻滯；而作用于MKN-28細(xì)胞、LOVO細(xì)胞及SW-116細(xì)胞，均發(fā)生較明顯的G0/G1阻滯，G2/M期細(xì)胞比例亦增多，而S期細(xì)胞比例明

11、顯減少。
　　 6、GA對3種化療藥物療效相關(guān)基因的影響：應(yīng)用RT-PCR檢測比較GA作用前后BGC-823細(xì)胞藥物療效相關(guān)基因的表達(dá).結(jié)果，GA明顯下調(diào)5-FU、Oxa及Doc療效相關(guān)基因TS、OPRT、ERCC1、BRCA1、tau及β-tublin-ⅢmRNA基因表達(dá).其中，TS下調(diào)至0.009，OPRT下調(diào)至0.745，ERCC1 mRNA下調(diào)至0.070，BRCA1 mRNA下調(diào)至0.140，tau mRNA下調(diào)至0.

12、267，β-tublin-III mRNA下調(diào)至0.624。
　　 7、GA對腫瘤細(xì)胞凋亡抑制基因survivin mRNA表達(dá)的影響：應(yīng)用RT-PCR檢測并比較GA作用前后BGC-823細(xì)胞凋亡抑制基因survivin mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)：GA明顯下調(diào)BGC-823細(xì)胞凋亡抑制基因survivin mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、單藥應(yīng)用時(shí)，GA對4株腫瘤細(xì)胞均有抗腫瘤活性，根據(jù)所測IC50值，LOVO細(xì)

13、胞對其最為敏感。
　　 2、GA與三種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，不同的細(xì)胞株，聯(lián)合用藥效應(yīng)不同。GA與Doc聯(lián)合作用于四株腫瘤細(xì)胞時(shí)在低濃度即可發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)；GA與Oxa或5-FU聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，除BGC-823細(xì)胞外，均需在較高濃度才可能發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)，甚或不產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，如GA與Oxa聯(lián)合作用于SW-116細(xì)胞。
　　 3、GA可以通過增加腫瘤細(xì)胞的凋亡和/或死亡從而發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)。
　　 4、GA可以通過抑制

14、腫瘤細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，或抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成，或殺滅S期細(xì)胞，或產(chǎn)生G2/M期阻滯，發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)。
　　 5、GA可以通過改變藥物療效相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)。
　　 6、GA可以通過改變腫瘤細(xì)胞株凋亡相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤協(xié)同效應(yīng)。
　　 7、二株大腸癌細(xì)胞株對Doc的敏感性高于二株胃癌細(xì)胞株，改變了大腸癌細(xì)胞對Doc天然耐藥的印象.臨床上，應(yīng)該根據(jù)藥物療效相關(guān)基因的表達(dá)情況，合理、個(gè)體化選擇