碳酸鈣納米介導(dǎo)shRNA抑制VEGF-C基因表達(dá)與大腸癌淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、結(jié)腸癌是胃腸道中常見(jiàn)的惡性腫瘤，2000年世界癌癥流行趨勢(shì)分析表明，全球結(jié)、直腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤第三位，死亡率居第四位。近些年來(lái)我國(guó)大腸癌發(fā)病率的上升趨勢(shì)亦十分明顯。其中城市結(jié)腸癌的發(fā)病率以4％的年增長(zhǎng)率遞增，而男性結(jié)腸癌患者增加了58.8％。由于其臨床表現(xiàn)常較隱匿且缺乏特異性，難以早期發(fā)現(xiàn)，許多患者就診時(shí)已屬于中晚期且大多數(shù)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。雖然，在200多年前有研究工作者認(rèn)識(shí)到腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤的預(yù)后因素之一，但其確切的機(jī)制不是很清

2、楚，因此，闡明腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制有助于腫瘤患者的預(yù)后以及選擇正確的治療方法。淋巴管形成促進(jìn)了腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，VEGF-C是目前己知的促淋巴管生長(zhǎng)因子，屬于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族成員之一，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在甲狀腺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌中VEGF-c表達(dá)與腫瘤新生淋巴管形成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF-C與其淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體VEGFR-3結(jié)合刺激淋巴管的生成和促進(jìn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，VEGF-C表達(dá)增高

3、通過(guò)增加腫瘤細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的接觸面積、增加管腔的通透性、改變淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞黏附性或黏附分子的表達(dá)使腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的能力增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)研究表明VEGF-C/VEGFR-3信號(hào)傳導(dǎo)在誘導(dǎo)淋巴管過(guò)程中起著重要作用，阻斷該信號(hào)通路是抗淋巴管生成治療目前最常用的策略；用于阻斷VEGF-C或VEGF-D與VEGFR-3相互作用的主要方法包括單克隆抗體、可溶性VEGFR-3-Ig、小分子肽抑制劑、前蛋白轉(zhuǎn)化酶(PCs)抑制劑、基因治療等。 R

4、AN干擾(RNAi)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)特異性抑制基因表達(dá)的新方法，它利用了由于小干擾RNA引起的生物細(xì)胞內(nèi)同源基因的特異性沉默現(xiàn)象，其本質(zhì)是siRNA與對(duì)應(yīng)的mRNA特異結(jié)合、降解，從而阻斷mRNA的翻譯，它普遍存在各種生物，是一種集快捷、高效、特異性強(qiáng)于一體的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，可廣泛用于基因功能測(cè)定及基因治療等方面。 基因治療的載體問(wèn)題以及載體相關(guān)的免疫反應(yīng)、細(xì)胞毒性與安全性問(wèn)題成為基因治療和臨床應(yīng)用的瓶頸。目前

5、，基因治療常用的載體系統(tǒng)主要包括兩大類：病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。病毒載體系統(tǒng)有慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體等，是目前基因治療研究中最常用的一類載體。腺病毒不能穩(wěn)定整合于宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，故難以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，甚至可能引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)：腺相關(guān)病毒載體容量小，難以為大片斷基因所利用，且制備困難；使得從逆轉(zhuǎn)錄病毒到腺病毒載體的安全性受到質(zhì)疑，研究者的目光亦從病毒載體轉(zhuǎn)移到非病毒載體上。傳統(tǒng)的非病毒載體如脂質(zhì)體、肽類化合

6、物、陽(yáng)離子聚合物等，雖然安全，但基因傳遞效率極低，難以獲得有意義的基因表達(dá)。因此，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)安全、有效并具有優(yōu)良特性的非病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)是發(fā)展基因治療的當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型非病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體-納米?；蜣D(zhuǎn)運(yùn)載體有望突破這一瓶頸，使基因治療發(fā)展成為臨床常規(guī)治療手段。納米顆粒因?yàn)榫哂行〕叽缧?yīng)，表面效應(yīng)，隨著顆粒直徑變小，比表面積將會(huì)顯著增大，故具有很高的化學(xué)活性，因而納米成為了最有應(yīng)用前景的非病毒載體。研究表明，納米顆粒

7、在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間明顯長(zhǎng)于普通大小的顆粒，在短時(shí)間內(nèi)，不會(huì)很快被吞噬細(xì)胞清除，從而更多的滲出到血管外、組織間隙，延長(zhǎng)與細(xì)胞的接觸時(shí)間，提高轉(zhuǎn)染效率；通常質(zhì)粒DNA進(jìn)入血管后很快被核酸酶消化降解，但納米基因載體有濃縮，保護(hù)DNA功能，與DNA形成一致密的結(jié)構(gòu)，使DNA不被核酸酶消化降解。 目的：用化學(xué)方法構(gòu)建一種新型非病毒轉(zhuǎn)基因載體-碳酸鈣納米，并以此載體轉(zhuǎn)染表達(dá)載體質(zhì)粒pGenesil-siRNA-VEGF-C，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和裸鼠

8、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)了解質(zhì)粒pGenesil-siRNA-VEGF-C能否特異性干擾大腸癌細(xì)胞株LOVO細(xì)胞中VEGF-C基因的表達(dá)以及能否影響裸鼠移植瘤中淋巴管的生成以及局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。 方法： 1.利用氯化鈣與碳酸鈉反應(yīng)生成碳酸鈣的原理制備新型非病毒轉(zhuǎn)基因載體-碳酸鈣納米；利用zetasize DELSA-400檢測(cè)碳酸鈣納米粒徑表面電荷和透射電子顯微鏡檢測(cè)碳酸鈣納米粒徑大小，通過(guò)瓊脂糖凝膠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)碳酸鈣納米對(duì)DNA的結(jié)合和保

9、護(hù)的最佳比例，并用流式細(xì)胞儀、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率及其對(duì)細(xì)胞的毒性。 2.采用Western blot、RT-PCR技術(shù)，在蛋白質(zhì)和mRNA水平檢測(cè)VEGF-C基因在不同消化道腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)。 3.利用計(jì)算機(jī)在線軟件設(shè)計(jì)針對(duì)VEGF-C基因特定序列的寡核苷酸片斷，并將其定向克隆入真核表達(dá)載體，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pGenesil-siRNA-VEGF-C1、pGenesil-siRNA-VEGF-C2、pGenesi

10、l-siRNA-VEGF-C3和陰性對(duì)照質(zhì)粒pGenesil-siRNA-HK。 4.用碳酸鈣納米將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大腸癌細(xì)胞株LOVO細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westren blot技術(shù)檢測(cè)VEGF-CmRNA和蛋白表達(dá)變化的情況，用MTT檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖抑制情況。 5.建立裸鼠移植瘤模型，進(jìn)行瘤內(nèi)注射質(zhì)粒，每3天一次，共8次，4周后處死裸鼠測(cè)腫瘤重量，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，免疫組化和Western blo

11、t技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織VEGF-C蛋白表達(dá)變化情況，免疫組化染色計(jì)數(shù)移植瘤組織中微淋巴管和微血管的密度，并計(jì)算移植瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)。 結(jié)果： 1.成功制備了一種新型的非病毒轉(zhuǎn)基因載體-碳酸鈣納米，其表面電荷為28.6mv，粒徑為58nm，與DNA結(jié)合的最佳比例為15:1，轉(zhuǎn)染效率為53.38％。 2.三株細(xì)胞均有VEGF-C表達(dá)，LOVO、SW-620、SGC-7901中VEGF-C蛋白的表達(dá)量分別是0.52±0.0

12、3，0.34±0.02， 0.31±0.03，LOVO細(xì)胞株中VEGF-C的蛋白量與SW-620、SGC-790l細(xì)胞株中VEGF-C蛋白量比較差別有顯著性SGC-7901、LOVO、SW-620中VEGF-C mRNA的表達(dá)量分別是0.27±0.03、0.64±0.04、0.30±0.02，LOVO細(xì)胞株中VEGF-CmRNA的表達(dá)量最高。與其它兩株細(xì)胞相比差別有顯著性。 2.經(jīng)酶切和測(cè)序分析證實(shí)成功構(gòu)建了真對(duì)VEGF-C基因

13、小分子RNA干擾表達(dá)載體質(zhì)粒。 3.重組質(zhì)粒pGeneesil-shRNA-VEGF-C1、pGeneesil-l-shRNA-VEGF-C2、pGeneesil-l-shRNA-VEGF-C3用碳酸鈣納米轉(zhuǎn)染入LOVO細(xì)胞三天后，蛋白表達(dá)抑制率分別為4.330％，35.437％，34.710％；mRNA的抑制率分別為3.079％，45.545％，43.178％。 4.重組質(zhì)粒pGeneesil-l-shRNA-VEGF