核呼吸因子2對腫瘤細(xì)胞線粒體功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及對其生物學(xué)行為的影響.pdf

1、核呼吸因子（nuclearrespiratoryfactor,NRF）,包括NRF-1和NRF-2,是調(diào)控線粒體DNA復(fù)制、保證線粒體功能完整和細(xì)胞正常生長發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，我們以往的結(jié)果顯示，正常細(xì)胞中NRF-1和NRF-2的轉(zhuǎn)錄水平與細(xì)胞的能量代謝密切偶聯(lián)，呈正相關(guān)關(guān)系。然而腫瘤細(xì)胞能量代謝特點(diǎn)為有氧氧化能力顯著下降、糖酵解能力顯著增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞中是否存在NRF對線粒體呼吸鏈轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面的障礙還未見報(bào)道。
　　為闡明NRF-

2、2在腫瘤中的功能和作用機(jī)制，本課題對人NRF-2的α、β亞基蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)并成功制備兔抗人NRF-2α、NRF-2β多克隆抗體和鼠抗人NRF-2α單克隆抗體，用免疫組化的方法研究NRF-2α在腫瘤組織中的分布特點(diǎn)；并采用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染和G418篩選，獲得能穩(wěn)定表達(dá)外源性NRF-2α蛋白的宮頸癌細(xì)胞系（HeLa-EGFP-NRF-2α）。通過RT-PCR、Westernblot檢測NRF-2α及其共激活物——過氧化物酶體增生物激活

3、受體γ共激活因子（Peroxisomeproliferator-activatedreceptorgammacoactivator-1,PGC-1）、下游靶基因線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrialtranscriptionfactorA，mtTFA）及線粒體呼吸鏈關(guān)鍵酶細(xì)胞色素氧化酶（CytochromeCoxidase，COX）等的變化情況；應(yīng)用MitoTracker染色、組織化學(xué)染色、圖像分析、ATP定量檢測觀察上調(diào)NRF-

4、2α表達(dá)對腫瘤細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)與功能的影響；通過MTT、生長曲線、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL和Hoechst染色等，并建立裸鼠體內(nèi)移植瘤模型來觀察上調(diào)NRF-2α表達(dá)對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡以及對化療藥物敏感性的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：1）成功制備兔抗人NRF-2α、NRF-2β多克隆抗體和鼠抗人NRF-2α單克隆抗體，免疫組化檢測到肝細(xì)胞癌、宮頸浸潤性鱗狀細(xì)胞癌和上皮內(nèi)瘤變組織中NRF-2α低表達(dá)。2）成功獲得了能穩(wěn)定表達(dá)外源性NRF-

5、2α蛋白并發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性功能的宮頸癌細(xì)胞系，命名為HeLa-EGFP-NRF-2α。3）HeLa-EGFP-NRF-2α細(xì)胞中NRF-2α的共激活物PGC-1、靶基因TFAM及線粒體呼吸鏈蛋白COX亞基、細(xì)胞色素C（cytochromeC,CytC）的表達(dá)上調(diào)；mtDNA拷貝數(shù)增加；線粒體膜電位升高；電鏡觀察示線粒體基質(zhì)密度增高；細(xì)胞內(nèi)ATP濃度上升。4）HeLa-EGFP-NRF-2α細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，細(xì)胞生長速度減慢。5）給與化療

6、藥物順鉑作用后，HeLa-EGFP-NRF-2α細(xì)胞生存率顯著降低、凋亡指數(shù)顯著高于對照組，細(xì)胞內(nèi)CytC、Bcl-2相關(guān)蛋白（Bcl-2-associatedXProtein，Bax）等基因的轉(zhuǎn)錄顯著增多。6）裸鼠體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)順鉑治療后，HeLa-EGFP-NRF-2α組腫瘤體積顯著縮小，抑瘤率顯著高于對照組，瘤組織中CytC、Bax表達(dá)顯著增多，COX活性增強(qiáng)。
　　綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們的研究首次用免疫組化的方法發(fā)

7、現(xiàn)宮頸浸潤性鱗狀細(xì)胞癌、上皮內(nèi)瘤變和肝細(xì)胞癌組織中NRF-2α低表達(dá)，揭示上述腫瘤中存在NRF-2對線粒體呼吸鏈基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面的障礙；證實(shí)上調(diào)NRF-2α表達(dá)抑制Skp2基因轉(zhuǎn)錄，使HeLa細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，細(xì)胞增殖活性減弱；體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)NRF-2α表達(dá)從轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)途徑提高了線粒體呼吸鏈蛋白表達(dá)和氧化磷酸化水平，促進(jìn)了HeLa細(xì)胞及裸鼠體內(nèi)移植瘤對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。為以NRF-2作為新的腫瘤基因治療靶點(diǎn)的研究提供了