WISP1與TLRs激動(dòng)劑在巨噬細(xì)胞中協(xié)同促炎機(jī)制的研究.pdf

1、背景：WISP1(CCN4)是Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活后誘發(fā)轉(zhuǎn)錄的基因之一，其編碼的蛋白屬于CCN蛋白家族，具有多種調(diào)控功能，是連接細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要因子。CCN蛋白通過結(jié)合整合素受體激活信號(hào)通路，而整合素信號(hào)通路的激活在急性肺損傷中發(fā)揮重要作用。近來研究發(fā)現(xiàn)WISP1是機(jī)械通氣誘導(dǎo)肺損傷的易感基因，而巨噬細(xì)胞在肺的炎癥反應(yīng)中具有重要作用。
　　目的：本研究擬在巨噬細(xì)胞模型中探討WISP1單獨(dú)或與TLRs

2、激動(dòng)劑共同刺激對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響，以揭示W(wǎng)ISP1在炎癥發(fā)生中的作用機(jī)制，為WISP1介入治療急性肺損傷提供新的理論基礎(chǔ)。
　　方法：首先在細(xì)胞水平，觀察WISP1在炎癥反應(yīng)中的作用，通過ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中促炎因子TNF-α的水平，比較直接給予WISP1刺激或RGDs預(yù)處理阻斷整合素通路后WISP1刺激對(duì)巨噬細(xì)胞分泌炎性因子的影響，并通過免疫印跡檢測(cè)下游信號(hào)因子p38MAPK、NF-κB的磷酸化水平，在分子水平探

3、討細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。其次通過分離脂筏或免疫熒光的方法檢測(cè)WISP1單獨(dú)或與LPS共同刺激對(duì)TLR4受體復(fù)合物向脂筏募集過程的影響。再次，觀察TLRs激動(dòng)劑刺激對(duì)巨噬細(xì)胞中整合素表達(dá)水平影響，并通過TLR相關(guān)通路基因敲除小鼠（TLR4、CD14、TRIF）驗(yàn)證TLR通路的完整性對(duì)整合素表達(dá)的重要性。最后，觀察WISP1與TLRs激動(dòng)劑共同刺激巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)性的變化，明確WISP1-整合素信號(hào)通路與TLR通路間的相互影響在

4、炎癥反應(yīng)中的作用。
　　結(jié)果：⑴WISP1單獨(dú)刺激RAW264.7細(xì)胞后，p38MAPK，NF-κB(P65)的磷酸化水平增加，促炎因子TNF-α的分泌增加(P＜0.01)。RGDS預(yù)處理阻斷整合素結(jié)合后，抑制TNF-α的分泌(P＜0.05)。表明整合素受體介導(dǎo)了WISP1的促炎作用。⑵WISP1增加MD2、整合素β3在脂筏分布。TLRs激動(dòng)劑刺激原代腹腔巨噬細(xì)胞后，AKT、p38MAPK、NF-κB通路磷酸化水平增加，整合素β1

5、，整合素β3的表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.01)，敲除TLR相關(guān)通路基因（TLR4、CD14、TRIF）后TLRs激動(dòng)劑上調(diào)整合素表達(dá)的作用降低甚至消失。此結(jié)果表明TLRs炎性信號(hào)通路的激活可上調(diào)WISP1整合素受體的表達(dá)。⑶WISP1與TLRs激動(dòng)劑共同刺激細(xì)胞后，TNF-α的水平較二者單獨(dú)刺激明顯增加(P＜0.05)，RGDS預(yù)處理后，二者共同作用與單獨(dú)刺激無明顯差異。進(jìn)一步證明整合素受體介導(dǎo)了WISP1與TLRs激動(dòng)劑之間的協(xié)同促炎作用