STAT3在激光誘導(dǎo)的大鼠脈絡(luò)膜新生血管中的表達(dá)及其對(duì)缺氧誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：脈絡(luò)膜新生血管(CNV)發(fā)生于多種眼部疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、眼組織胞漿菌病(OHS)、病理性近視和眼外傷等。CNV常累及黃斑，可因反復(fù)滲出、出血及瘢痕形成導(dǎo)致中心視力喪失，是主要致盲原因之一。當(dāng)前眼科界關(guān)于CNV生成機(jī)制的研究已成為熱點(diǎn)，以期尋找能夠有效防治CNV的途徑。
　　CNV的病因尚未闡明，缺血缺氧可能是CNV形成重要的始動(dòng)因素。局部微環(huán)境的改變可致脈絡(luò)膜毛細(xì)血管閉塞、萎縮以及纖維化等引起脈絡(luò)膜供

2、血不足，因而視網(wǎng)膜缺血缺氧，刺激視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞分裂和增生，并分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致脈絡(luò)膜毛細(xì)血管向外層視網(wǎng)膜代償性生長(zhǎng)，最后形成CNV。
　　VEGF是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的促血管形成因子，也是重要的促細(xì)胞分裂素，缺氧可上調(diào)其表達(dá)。RPE細(xì)胞是CNV中主要的細(xì)胞成分，缺氧誘導(dǎo)RPE細(xì)胞表達(dá)VEGF可能是CNV發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VEGF受多種刺激因素的影

3、響，牽涉的分子生物學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜，這使得以抑制VEGF為目的的治療手段受到很大挑戰(zhàn)。
　　雖然VEGF的誘導(dǎo)因素眾多，但研究表明缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是細(xì)胞內(nèi)兩種關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄激活因子，可作用于VEGF啟動(dòng)子，直接調(diào)控VEGF的表達(dá)。HIF-1是缺氧反應(yīng)中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)與基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其他調(diào)控區(qū)內(nèi)的HIF-1特異組合序列結(jié)合，參與缺氧誘導(dǎo)VEGF等基因的表達(dá)，在血管形成過(guò)程

4、中發(fā)揮重要作用。STATs是一類(lèi)通過(guò)酪氨酸磷酸化激活的具有SH2同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族，多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等多肽類(lèi)配體可參與其激活。實(shí)驗(yàn)表明，STAT3參與了細(xì)胞對(duì)缺氧的應(yīng)答，缺氧2h時(shí)即觀察到肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化STAT3蛋白表達(dá)顯著升高。近期研究發(fā)現(xiàn)，STAT3的異?；罨谡T導(dǎo)腫瘤新生血管的形成中具有重要作用。缺氧可激活人腎癌細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并通過(guò)活化HIF-1α蛋白協(xié)同調(diào)控VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管發(fā)生

5、。
　　目的：
　　(1)觀察激光誘導(dǎo)的大鼠CNV形成早期磷酸化STAT3的定位；
　　(2)建立體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞物理缺氧模型，觀察缺氧狀態(tài)下RPE細(xì)胞STAT3的活性變化；
　　(3)運(yùn)用JAK2激酶抑制劑AG490研究JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)缺氧誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞增生以及HIF-1α活化和VEGF表達(dá)的影響。
　　方法：
　　(1)建立激光誘導(dǎo)的BN大鼠CNV模型，以免疫

6、熒光法觀察CNV生成早期磷酸化STAT3的定位；
　　(2)將培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為1％O2、5％CO2和94％N2的培養(yǎng)箱內(nèi)建立缺氧模型，分別培養(yǎng)1、3、6、12和24h。采用RT-PCR和Western blot方法觀察STAT3及其磷酸化表達(dá)水平的變化，免疫熒光法觀察RPE細(xì)胞內(nèi)STAT3定位的改變；
　　(3)用30μMJAK2激酶抑制劑AG490處理RPE細(xì)胞，在缺氧條件下分別培養(yǎng)1、3、6、12和24

7、h，用流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)檢測(cè)JAK2/STAT3信號(hào)通路阻斷前后缺氧RPE細(xì)胞的增生指數(shù)，以RT-PCR和Western blot方法觀察HIF-1αmRNA和蛋白的表達(dá)，RT-PCR觀察VEGFmRNA表達(dá)，ELISA檢測(cè)人RPE細(xì)胞上清中VEGF的含量。
　　結(jié)果：
　　(1)在激光誘導(dǎo)的大鼠CNV生成第3d，即可見(jiàn)磷酸化STAT3高表達(dá)于CNV區(qū)域，且主要定位于參與CNV生成的增生移行的

8、RPE細(xì)胞中；
　　(2)RT-PCR和Western blot顯示，正常培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞內(nèi)STAT3mRNA和蛋白表達(dá)量微弱。隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，STAT3表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，至12h達(dá)到峰值，24h開(kāi)始下降，但仍高于常氧狀態(tài)；免疫熒光顯微鏡觀察，常氧狀態(tài)下，STAT3蛋白熒光主要分布于RPE細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。缺氧后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度減弱，細(xì)胞核熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；
　　(3)FCM檢測(cè)AG490處理組細(xì)胞增生指數(shù)明顯低于對(duì)照組(

9、P<0.05)；隨缺氧時(shí)間的增加，RT-PCR顯示HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，至6h達(dá)峰值；Western blot檢測(cè)缺氧后HIF-1α逐漸被活化，至12h達(dá)到峰值，24h開(kāi)始下降；AG490處理組較對(duì)照組中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的表達(dá)以及HIF-1α蛋白的活化均受到明顯抑制；ELISA證實(shí)，缺氧條件下培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞上清液中VEGF含量隨時(shí)間逐漸增加，而AG490處理組RPE細(xì)胞條件培養(yǎng)液中