非小細(xì)胞肺癌缺氧誘導(dǎo)因子-2α表達(dá)與腫瘤脈管生成和上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)變的關(guān)系.pdf

1、背景:
　　肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌總數(shù)約80％，盡管人們根據(jù)不同的肺癌分期采用了包括手術(shù)切除、化療、放療及靶向藥物治療在內(nèi)的綜合治療方案，但從1975年到2011年NSCLC的總體五年生存率改善并不明顯，只是從13％增加到16％，早期可切除NSCLC的5年生存率也只有60％～70％，最終1/4～1/3的患者仍死于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。為進(jìn)

2、一步改善NSCLC患者的治療效果和預(yù)后，迫切需要研究與NSCLC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，并根據(jù)其信號(hào)通路和關(guān)鍵調(diào)控因子設(shè)計(jì)和尋找抗侵襲和轉(zhuǎn)移的新途徑。大量研究已經(jīng)證實(shí)缺氧可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在這個(gè)過(guò)程中，缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)家族起著非常重要的作用。HIF-1和HIF-2是缺氧誘導(dǎo)因子家族中最重要的兩種參與組織乏氧調(diào)控的因子，盡管在基因序列上HIF-1α和HI

3、F-2α之間具有明顯的同源性，但他們?cè)谀[瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要的但不重疊的作用。近年來(lái)在乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤的一些研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α而不是HIF-1α為促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的主要調(diào)節(jié)因子，HIF-2α與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移以及預(yù)后關(guān)系密切，HIF-2α可能是NSCLC患者評(píng)估腫瘤惡性風(fēng)險(xiǎn)一個(gè)有用的指標(biāo)和潛在的一個(gè)腫瘤防治目標(biāo)。然而，HIF-2α是通過(guò)哪些途徑促進(jìn)NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移以及相關(guān)的分子機(jī)制仍然不清楚。腫瘤血管生成和淋巴管生成

4、對(duì)實(shí)體瘤經(jīng)血管、淋巴管播散具有重要的作用，是發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要途徑，其中VEGF-A、 VEGF-C分別是調(diào)控血管生成和淋巴管生成的主要因子。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial- mesenchvmal transition，EMT)是近年來(lái)包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)，大量研究表明腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后侵襲性明顯增強(qiáng)，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。NSCLC腫瘤組織中HIF-2α是否通過(guò)影響腫瘤血管生成和淋巴管生成以及EMT促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移至

5、今仍不明確。
　　目的:
　　探討HIF-2α在非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展過(guò)程中的作用及其與腫瘤血管生成和淋巴管生成和EMT的關(guān)系。
　　方法:
　　1.采用免疫組織化學(xué)染色法觀察52例手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α、HIF-1α蛋白的表達(dá)情況，分析HIF-2α、HIF-1α蛋白與肺癌臨床病理因素的關(guān)系。
　　2.采用CD31和D2-40分別標(biāo)記腫瘤微血管和微淋巴管，免疫組織化學(xué)染色染色法觀察腫瘤微血管密度

6、和微淋巴管密度以及VEGF-A、VEGF-C蛋白的表達(dá)情況，分析HIF-2α、HIF-1α蛋白與腫瘤血管生成和淋巴管生成的關(guān)系。
　　3.采用免疫組織化學(xué)染色法觀察EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，分析HIF-2α、HIF-1α蛋白表達(dá)與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系。
　　4.構(gòu)建特異性HIF-2α siRNA表達(dá)載體，并借助脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)入人肺癌A549細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549

7、細(xì)胞）和HIF-2α siRNA組(HIF-2αsiRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞)。采用光鏡動(dòng)態(tài)觀察、Real time PCR以及Western Blotting、細(xì)胞免疫熒光染色等方法在細(xì)胞形態(tài)、mRNA、蛋白水平檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)變化，分析HIF-2α對(duì)人肺癌A549細(xì)胞EMT和VEGF-A、VEGF-C表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:
　　1.本組52例非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α蛋白表達(dá)和HIF-1α蛋白表達(dá)不相

8、關(guān)(P＞0.05); HIF-2α蛋白表達(dá)與腫瘤血管侵犯、淋巴管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（均P＜0.01），HIF-1α蛋白表達(dá)與各臨床病理因素均不相關(guān)（均P＞0.05）;單因素生存分析顯示HIF-2α蛋白陽(yáng)性表達(dá)組生存率明顯低于陰性表達(dá)組(P=0.012)，HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)組與陰性表達(dá)組生存率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); COX多因素生存分析表明HIF-2α而不是HIF-1α蛋白表達(dá)是NSCLC患者術(shù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素

9、。
　　2.本組52例非小細(xì)胞肺癌組織HIF-2α蛋白表達(dá)陽(yáng)性組的未形成完整管腔的MVD值及LMVD值均大于HIF-2α陰性組(P=0.000，0.031)，HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性組與HIF-1α表達(dá)陰性組中MVD、未形成完整管腔的MVD、LMVD相比，差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），HIF-2α表達(dá)與VEGF-A、VEGF-C表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.428，0.316，P=0.002，0.022)。
　　3.本組5

10、2例非小細(xì)胞肺癌組織HIF-2α蛋白表達(dá)與E-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.451，P=0.001)，HIF-2α蛋白表達(dá)與Vimentin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.321，P=0.020)。
　　4.乏氧的肺癌A549細(xì)胞的HIF-2α蛋白表達(dá)明顯增高，而E-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低，同時(shí)Vimentin、Twist、VEGF-A和VEGF-C蛋白表達(dá)均增高，細(xì)胞由上皮型生長(zhǎng)模式向間質(zhì)型生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變。
　

11、　5.成功構(gòu)建了HIF-2α siRNA表達(dá)載體并且能高效轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞內(nèi)。與陰性對(duì)照組比較，三對(duì)siRNA-HIF-2α中以HIF-2α-siRNA-1331對(duì)HIF-2α蛋白沉默效果最為顯著（P均＜0.05），轉(zhuǎn)染HIF-2α-siRNA-1331組中HIF-2α mRNA沉默效率達(dá)到了70.27％。HIF-2α-siRNA轉(zhuǎn)染乏氧培養(yǎng)的A549細(xì)胞后，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，Real time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示E-cad

12、herin mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增高（均P＜0.01），Twist和VEGF-A mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低(均P＜0.05);Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增高(P＜0.01)，Vimentin、Twist、VEGF-A和VEGF-C蛋白表達(dá)均明顯降低（均P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.非小細(xì)胞肺癌組織中HIF-2α蛋白陽(yáng)性表達(dá)不僅與非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，也可

13、作為判斷非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一。
　　2.HIF-2α對(duì)非小細(xì)胞肺癌血管生成和淋巴管生成起正調(diào)控作用，LMVD和未形成完整管腔的MVD增多，可能為癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移提供更多的途徑，從而具有更高的發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。
　　3.HIF-2α可通過(guò)上調(diào)VEGF-A、VEGF-C的表達(dá)分別促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌血管生成和淋巴管生成。
　　4.HIF-2α參與了非小細(xì)胞肺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變過(guò)程，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。