基于大腸桿菌可溶性表達(dá)的戊型肝炎病毒樣顆粒的體外組裝及其應(yīng)用.pdf

1、戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)是一種無包膜的RNA病毒，主要可引起急性戊型肝炎（HepatitisE，HE），會(huì)造成消化道相關(guān)的食欲不振、惡心、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重的患者甚至?xí)l(fā)生肝衰竭乃至死亡，尤其在育齡期婦女、慢性肝病患者、老年人和嬰幼兒中有著較高的病死率，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的病原體，引起了眾多研究者的關(guān)注。
　　 由于缺乏有效的HEV細(xì)胞培養(yǎng)模型，對(duì)HEV的病毒顆粒組裝、感染機(jī)制研究和疫苗開發(fā)主要是

2、通過各種外源表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行的。HEVORF2aa112-606編碼的蛋白(p495)可在昆蟲細(xì)胞中體內(nèi)組裝成等二十面體對(duì)稱的病毒樣顆粒（VirusLikeParticle，VLP），但體外重組裝和利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得該蛋白片段的病毒樣顆粒等未見報(bào)道，體外組裝可控制核酸的包裹，從而制備具有感染和入胞能力的假病毒，可用于病毒-細(xì)胞相互作用、病毒入胞機(jī)制、病毒受體研究和疫苗效力評(píng)價(jià)，本研究在課題組成功研制世界上第一個(gè)重組戊型肝炎疫苗p239

3、的基礎(chǔ)上，利用原核表達(dá)系統(tǒng)開展p495蛋白的表達(dá)、體外組裝、免疫原性和假病毒包裝等研究，以期為戊型肝炎病毒的研究提供新的工具。
　　 首先，本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)p495蛋白，并通過突變分析發(fā)現(xiàn)，Leu244為p495蛋白可溶性表達(dá)的關(guān)鍵位點(diǎn)。采用陰離子交換層析等方法獲得純度約90％的p495蛋白，通過摸索蛋白顆粒組裝的條件，包括組裝時(shí)溶液的pH、鹽離子濃度和溫度等，確定20-50mMPB6.5、0.5MNaCl、

4、37℃是p495的顆粒體外組裝的較優(yōu)條件，并發(fā)現(xiàn)Pro284為p495蛋白組裝的關(guān)鍵位點(diǎn)之一。
　　 其次，透射電鏡觀察和動(dòng)態(tài)光散射測定顯示，p495可形成為形態(tài)均一、半徑為15rim左右的VLP;免疫反應(yīng)性分析表明，p495與各種HEV特異單抗反應(yīng)性良好，與p239的反應(yīng)性相當(dāng);p495在小鼠體內(nèi)的半數(shù)有效劑量(ED50)為0.068μg，0.5μg劑量可誘導(dǎo)的小鼠抗體水平為105，與已上市的p239疫苗Hecolin(@)免

5、疫原性相當(dāng)。
　　 再次，細(xì)胞入胞實(shí)驗(yàn)表明，p495可吸附并進(jìn)入HEV易感細(xì)胞HepG2，將能夠表達(dá)GFP的質(zhì)粒載體與其進(jìn)行共組裝，采用HPLC分子篩的雙波長紫外檢測和組裝顆粒的細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)，提示p495可包裹質(zhì)粒DNA，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP報(bào)告基因，顯示了用于制備HEV假病毒的可行性。
　　 綜上所述，本研究首次利用大腸桿菌可溶性表達(dá)了HEVp495蛋白，其中的Leu244和Pro284分別在可溶性表達(dá)和顆粒組裝中起重