南美角蛙皮膚活性多肽資源發(fā)掘和南美角蛙鎮(zhèn)痛肽結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、兩棲類的皮膚中含有種類繁多、功能復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)可用來(lái)抵御有害環(huán)境因子的侵襲。是有待于開(kāi)發(fā)的寶庫(kù)。目前，已從兩棲類動(dòng)物中分離鑒定出許多具有多種生物活性的蛋白及多肽。南美角蛙(Ceratophryscranwelli)，屬于細(xì)趾蟾科角花蟾屬，分布于阿根廷，玻利維亞，巴西大峽谷地帶。其白化體也叫黃金角蛙，常被當(dāng)成寵物飼養(yǎng)。本研究以南美角蛙為研究對(duì)象，通過(guò)生物化學(xué)、分子生物學(xué)等手段，對(duì)南美角蛙皮膚中活性多肽資源進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)

2、了南美角蛙皮膚鎮(zhèn)痛肽并對(duì)其結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行了研究。
　　 以來(lái)源于單個(gè)南美角蛙(Ceratophrys cranwelli)個(gè)體皮膚中提取的mRNA為材料，我們建立了南美角蛙皮膚cDNA文庫(kù)，得到大約為1×106個(gè)獨(dú)立的克隆。通過(guò)PCR的方法，以M13引物隨機(jī)篩選插入片段在500-10001bp的克隆。共挑選了142個(gè)克隆并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast，其中62條序列可以得同源性序列。其中11條為活性多肽的序列，例如半

3、胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)，溶菌酶(Lysozyme)，性信息素(sodefrin)等等。南美角蛙中編碼這些活性多肽的基因與親緣性較近的非洲爪蟾中基因同源性較高，相似性最高可達(dá)76％，具有一定的特異性。活性多肽基因也具有多樣性的特點(diǎn)。
　　 通過(guò)對(duì)南美角蛙皮膚cDNA文庫(kù)的隨機(jī)篩選，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有氨基酸序列多拷貝現(xiàn)象的基因。經(jīng)過(guò)翻譯發(fā)現(xiàn)，在編碼區(qū)內(nèi)有6個(gè)拷貝，每個(gè)拷貝長(zhǎng)19個(gè)氨基酸殘基，并且每個(gè)拷貝的氨基酸序列都不完

4、全相同，有一定的多樣性。每個(gè)拷貝N端前兩位氨基酸序列為KR，是兩棲動(dòng)物典型的翻譯后加工位點(diǎn)。除去該位點(diǎn)，還有17個(gè)氨基酸。
　　 通過(guò)固相合成法合成了三條多肽，分別為CCAP1(TNGKGYQVENEDDYGDY)、CCAP2(TNGKDYQVENEDDYGDY)和CCAP3(TSGNGYQEENENDYGDY)。并進(jìn)行了抗菌活性、抗氧化活性、緩激肽活性和鎮(zhèn)痛活性檢測(cè).發(fā)現(xiàn)該類多肽具有鎮(zhèn)痛活性，是一種鎮(zhèn)痛肽。通過(guò)鼠尾光照鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)